http://hdl.handle.net/10451/20 2013-05-23T15:03:17Z 2013-05-23T15:03:17Z Sousa, Sara Homem http://hdl.handle.net/10451/8494 2013-05-22T14:00:13Z 2011-01-01T00:00:00Z

Title: Produção e caracterização de quitinases ácidas de macieira em Pichia Pastoris Authors: Sousa, Sara Homem Abstract: Este trabalho visou a clonagem e expressão de genes codificadores de quitinases ácidos de classe III de macieira no sistema heterólogo Pichia pastoris, nas estirpes GS115 e KM71H. Prepararam-se três construções com três genes já anteriormente identificados (C525, C209 e C203) e o sinal de secreção α-factor de S. cerevisiae, e duas construções com os genes C525 e C209 com o sinal de secreção nativo. Estas construções foram clonadas no vector pPICZαA e introduzidas na levedura. Obtiveram-se colónias positivas para todas as construções, excepto para a C209 com o sinal de secreção nativo, sugerindo uma análise de Southern a presença de apenas uma cópia da construção em cada recombinante. Após indução da expressão com metanol, mediu-se, em vários momentos, o crescimento e o teor total de proteína das culturas, bem como a actividade quitinolítica do secretoma das colónias recombinantes, usando glicolquitina como substrato. Seleccionaram-se as construções que apresentaram, pelo menos numa estirpe, actividade superior à dos controlos negativos correspondentes (estirpes WT e WT+pPICZαA), e os momentos que permitiram maior actividade enzimática para cada construção. Os melhores resultados foram obtidos para as isoformas C525 com o sinal de secreção nativo e C209 com o sinal de secreção α-factor, clonadas na estirpe GS115 (1,100U/mg de proteína às 24h e 0,233U/mg de proteína às 120h, respectivamente), e a isoforma C525 com o α-factor, clonada na estirpe KM71H (0,366U/mg de proteína às 139h). Destas três, a primeira foi a que expressou melhor e mais rapidamente a proteína. A análise de SDS-PAGE dos precipitados e dos secretomas respeitantes aos diferentes momentos não se revelou conclusiva, provavelmente devido à baixa concentração proteica das amostras. Propõe-se a produção em larga escala e purificação destas três proteínas recombinantes para caracterizar a sua actividade quitinolítica, para depois averiguar o seu potencial biofungicida contra fitopatogénios de macieira e pereira.; This work focused on cloning and expressing three different genes encoding class III acidic chitinases from apple in Pichia pastoris heterologous expression system, using GS115 and KM71H strains. Three constructs were prepared with the genes C525, C209 e C203 and the α-factor secretion signal from S. cerevisiae, and two constructs with the genes C525 and C209 and the native secretion signal. The constructions were cloned in pPICZαA vector and introduced in the yeast. We obtained positive clones for all constructs, except for construct C209 with the native secretion signal, and a Southern analysis suggested the presence of only one copy of the construct in each recombinant. After inducing the expression with methanol, cultures‟ growth and total protein amount, at different moments, were evaluated, and the chitinolytic activity of the cell-free‟s medium was determined, using glycolchitin as substrate. The constructs that showed, at least in one strain, higher activity than the corresponding negative controls (WT strain and WT+pPICZαA) were chosen, as well as the moments with better enzymatic activity, for each construct. The best results derived from C525 gene with the native secretion signal and C209 gene with the α-factor signal, cloned in the GS115 strain (1,100U/mg protein at 24h and 0,233U/mg protein at 120h, respectively), and C525 gene with the α-factor signal cloned in the KM71H strain (0,366U/mg protein at 139h). Among these three, the first is the one that expressed the protein better and faster. A SDS-PAGE analysis of the pellets and supernatants from the different moments didn‟t show the expected results, probably due to the samples‟ low protein concentration. We propose to produce in large scale and purify these three recombinant proteins to characterize their chitinolytic activity and further analyze their potential as natural fungicide against phytopathogens that strongly affect apple and pear. Description: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011

2011-01-01T00:00:00Z Forte, Ana Rita Taveira http://hdl.handle.net/10451/8492 2013-05-22T10:58:43Z 2011-01-01T00:00:00Z

Title: Ensaio de colectores solares térmicos: fiabilidade e rendimento Authors: Forte, Ana Rita Taveira Abstract: The tests on reliability of the solar thermal collectors allows us to ensure that they are able to withstand adverse effects, such as high pressure inside, degradation by action of solar radiation, thermal shocks inside and outside, degradation of the collector by action of the wind, snow or hail, the entrance of water and the icing of the collector. Besides, the efficiency tests, has the role of determining the thermal behaviour of the collector. Over the years these tests have changed so that they will simulate the worst conditions and became as reliable as possible. As such, there is a new version proposed to amend the rule known as European EN 12975:2006. This dissertation has two distinct objectives. The first objective is to implement a test of rain penetration according to the new proposal to revise the European rule EN 12975:2006. The second objective is the validation of a tool that calculates the energy produced by the collector to the latitude of Stockholm. Throughout this document will be presented the procedures used to develop the tests of reliability for the actual rule and also for the new proposal of amend. For better understanding of the tests on reliability, there will be shown the changes that occurred during the existence of these procedures of test.; Os ensaios de fiabilidade a colectores solares térmicos permitem assegurar que os mesmos são capazes de suportar efeitos adversos, tais como, pressões elevadas no seu interior, degradação por acção da radiação solar, choques térmicos no seu interior ou exterior, degradação do colector pela acção do vento, neve ou granizo, entrada de água e o congelamento do colector. Além disso, os ensaios de rendimento têm como função a determinação do comportamento térmico do colector. Ao longo dos anos estes ensaios têm sofrido alterações, para que simulem as piores condições, sendo o mais fidedignos possível. Como tal, existe uma nova versão proposta para alteração da norma europeia EN 12975:2006. Esta dissertação tem dois objectivos distintos. Um dos objectivos consiste na execução do ensaio de penetração de chuva de acordo com a nova proposta de revisão à actual norma europeia EN 12975:2006. O segundo objectivo consiste na validação de uma ferramenta de cálculo da energia fornecida pelo colector para a latitude de Estocolmo. Ao longo desta dissertação serão apresentados os procedimentos da sequência de ensaio de fiabilidade da actual norma e também da nova proposta de revisão. Para uma melhor compreensão dos ensaios de fiabilidade serão apresentadas as alterações que ocorreram ao longo da existência destes procedimentos de ensaio. Description: Tese de mestrado integrado em Engenharia da Energia e do Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011

2011-01-01T00:00:00Z Costa, Daniel Filipe Ribeiro da http://hdl.handle.net/10451/8490 2013-05-22T10:16:31Z 2011-01-01T00:00:00Z

Title: Self-adaptation of multimodal systems Authors: Costa, Daniel Filipe Ribeiro da Abstract: Este documento centra-se nos Sistemas Multimodais Adaptativos e suas aplicações no melhoramento da acessibilidade das interfaces. Pessoas idosas ou com algum tipo de deficiência, seja associado ou não à idade, são um grupo de alto risco sujeito à exclusão social. Muitas vezes o acesso a oportunidades ou serviços oferecidos pela sociedade é limitado ou mesmo inacessível para indivíduos com estas características. No caso específico da comunicação pessoa-máquina, um exemplo de falta de acessibilidade resulta das modalidades utilizadas para interagir ou apresentar informação. Se for usada apenas informação visual, alguém com dificuldades visuais não conseguirá interagir ou perceber a informação apresentada, logo é excluída. Como solução para estes problemas, neste documento apresenta-se GUIDE, um projecto europeu que pretende desenvolver uma framework que permite integrar eficientemente características de acessibilidade nas aplicações. Este projecto foca-se nas plataformas e serviços emergentes para TV e pretende transformar as Set-Top Box’s em sistemas multimodais adaptativos. São apresentados os objectivos do GUIDE, o papel da Faculdade de Ciências neste projecto e as contribuições desta tese. No segundo capítulo deste documento é apresentada a noção de Sistemas Multimodais Adaptativos, as vantagens associadas a este tipo de sistemas, arquitectura e descrição dos vários componentes. Um sistema multimodal ´e um sistema que disponibiliza várias modalidades para interagir (voz, gestos, etc), sendo possível a utilização de apenas uma ou várias modalidades em simultâneo. Estes sistemas não só oferecem ao utilizador uma comunicação mais natural como permitem alternativas tanto na maneira de interagir como de apresentar a informação a pessoas que, devido `as suas características, de outra maneira não conseguiriam. A outra característica destes sistemas é a adaptação, que pode ser descrita como um método para aumentar a usabilidade de uma aplicação em termos de eficiência, eficácia e facilidade de uso. Este método traz benefícios para a interação¸ ao do utilizador em diversas situações e pode ser aplicado em diferentes níveis de automação apresentados neste documento, sendo o mais interessante a auto-adaptação. Geralmente, a arquitectura de um sistema deste tipo ´e composta por reconhecedores para as modalidades de input, sintetizadores para as modalidades de output e entre eles, um conjunto de componentes responsável pela integração multimodal do sistema. Esses componentes são: um módulo de fusão (para os inputs) e outro de cisão (para outputs), um gestor de diálogo (Dialogue Manager) e um gestor de contexto. A descrição e função de cada componente são detalhadas também no capítulo 2. Esta tese dá especial destaque ao Dialogue Manager, cuja responsabilidade é coordenar a actividade dos vários componentes do sistema, manter a representação do estado actual do diálogo, actualizar o contexto do diálogo com base na informação interpretada na comunicação e decidir que conteúdo deve ser apresentado e quando, deixando a forma como é apresentado para o módulo de cisão. Das várias abordagens existentes para a implementação do Dialogue Manager, a que vem de encontro aos requisitos do projecto e está descrita neste documento chama-se “Frame-based approach”. Esta implementação aplica a analogia do preenchimento de um formulário, ou seja, interpreta o diálogo de um certo estado da aplicação como a necessidade de se verem realizadas certas condições para efectuar uma acção. Cada estado da aplicação pode conter vários formulários e o preenchimento de cada um deles resulta numa accão, que normalmente leva a estados diferentes da aplicação. Contudo,também é possível haver accões que são independentes da aplicação, como por exemplo pedir ao GUIDE para aumentar o volume. Estes formulários são instanciados automaticamente pelo Dialogue Manager. Pelo contrário, os formulários relativos à aplicação têm de ser inferidos a partir de uma representação da interface da aplicação Para realizar um projecto deste tipo é preciso conhecer melhor os futuros utilizadores. Por isso, foram realizados dois estudos feitos com utilizadores-alvo que pretendiam entender como os idosos reagiriam a novas maneiras de interagir com a sua televisão bem como as suas preferências em relação à apresentação da informação e dos elementos interactivos. As descobertas feitas são relatadas nesta tese e serviram não só para ajudar no desenvolvimento do Dialogue Manager mas também todos os outros componentes envolvidos. Outro dos principais objectivos destes estudos foi perceber que diferentes agrupamentos se pode criar para caracterizar e agrupar futuros utilizadores. Para esse fim foi implementado um protótipo que integra diferentes dispositivos para interação (ex: WiiMote, Kinect) e que permite a criação de interfaces multimodais recorrendo à descrição dos elementos que desejamos ver no ecrã num ficheiro XML. Os sistemas adaptativos dependem de informação guardada em modelos como base para aplicar a adaptação. Existem diferentes modelos tendo em conta os diferentes tipos de informação que se quer manter: modelo de utilizador, modelo da tarefa, modelo de domínio, modelo de diálogo, modelo de ambiente, etc. Desses modelos destaca-se o modelo de utilizador pois é o mais importante no campo dos sistemas adaptativos. O modelo de utilizador é a representação do conhecimento e preferências que o sistema “acredita” ser o que o utilizador possui. Toda esta informação é importante para melhorar a interação e portanto deve ser mantida e actualizada. Neste documento são também descritas as técnicas para a aquisição¸ ao desse conhecimento, existindo dois processos diferentes para o fazer: explicitamente e implicitamente. Observando o utilizador e o seu compor tamento é possível obter as informações implicitamente. Perguntando directamente ou permitindo ao utilizador alterar o modelo de utilizador a aquisição de informação está a ser feita explicitamente. Neste documento é apresentado um protótipo que pretende servir como um tutorial de modo a ensinar ao utilizador como interagir com o sistema mas também obter informações sobre ele de maneira a poder atribuí-lo a um dos agrupamentos encontrados nos estudos feitos anteriormente. Este protótipo obtém essas informações pedindo ao utilizador para efectuar certas tarefas e respondendo a algumas perguntas. Como foi referido anteriormente, o Dialogue Manager bem como outros componentes lidam com as aplicações através de uma representação da interface de utilizador. Neste documento é feito uma comparação entre algumas linguagens que têm este objectivo e é escolhido então o formato que vai ser usado neste projecto. Para extrair automaticamente essa representação, no capítulo 6 é apresentado uma ferramenta que o faz a partir de aplicações Web, ou seja implementadas em HTML e Javascript. Esta ferramenta analisa a estrutura dos elementos apresentados através da análise do código HTML bem como de algumas propriedades WAI-ARIA, desenhadas com o propósito da acessibilidade. De seguida, percorre e analisa não só o código HTML com também o CSS, de modo a descrever as propriedades visuais dos elementos que vão ser apresentados no ecrã. Finalmente, todo o trabalho resultante desta tese continuará a ser melhorado e avaliado até ao final da duração deste projecto que contará ainda com 1 ano e 3 meses. Durante esse período será realizada a integração dos vários componentes e será feita a migração das versões em PC para Set-top-box. No fim ´e esperado que todos os objectivos a que este projecto se propôs sejam cumpridos e que pelo menos facilite a vida daqueles que são afectados pela falta de acessibilidade nas tecnologias existentes.; This thesis focuses on Adaptive Multimodal Systems and their applications on improving user interface accessibility. Disabled and/or elderly people are a group at high risk of social exclusion. The access to the opportunities offered by society is obviously limited if these cannot be reached by persons with impairments or restricted mobility. A more subtle way of exclusion results from the sensory modalities in which they are presented. Therefore, if the presentation of information has only one modality it will exclude people with impairments in that particular sensory modality. As a solution to these problems, this document presents GUIDE, an European funded project which intends to develop a software framework which allows developers to efficiently integrate accessibility features into their applications. To perform adaptation the system must know the users, their characteristics and preferences. Thus, a prototype was implemented to assist in user trials. These trials had the goal to understand users’ interaction patterns as well as to group users with common characteristics. In order to match a user with its cluster, it was implemented a prototype named User Initialisation Application (UIA) that besides of tutoring the user on how to interact with the system, it asks the user to perform some tasks and answer some questions. When finished the UIA is able to decide which group the user identifies with. This thesis takes special focus on Dialogue Manager as it is the core component of the system architecture. It coordinates the activity of several subcomponents in a dialogue system and its main goal is to maintain a representation of the current state of the ongoing dialogue. This document presents the design of the Dialogue Manager that will run in the GUIDE framework. Additionally, in order to the Dialogue Manager and the other components understand the applications’ user interface it was implemented a tool that extracts a User Interface Markup Language (UIML) from a Web based application. Description: Tese de mestrado em Engenharia Informática (Sistemas de Informação), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011

2011-01-01T00:00:00Z Silva, Andreia Marisa Cruz e http://hdl.handle.net/10451/8489 2013-05-21T15:12:22Z 2011-01-01T00:00:00Z

Title: Calcium signalling modulation in astrocytes by adenosine receptors Authors: Silva, Andreia Marisa Cruz e Abstract: O modelo de sinapse actualmente aceite considera que para o processo de comunicação neuronal contribuem não só os neurónios pré- e pós-sináptico mas também um elemento peri-sináptico, os astrócitos. Estes constituem a população de células mais abundante no cérebro, formando juntamente com a micróglia e os oligodendrócitos a rede de células da glia. Presentemente, sabe-se que os astrócitos não são meros elementos passivos, comunicando activamente com as outras células através do seu mecanismo de excitabilidade que usa iões de cálcio (Ca2+) como mensageiro interno para desencadear a gliotransmissão. Este fenómeno é despoletado pela activação de receptores membranares e consiste na libertação de gliotransmissores (GT) como o glutamato, ATP e D-serina. A libertação de GT parece exercer uma função com características em certa medida semelhantes à libertação de neurotransmissores (NT) pelos neurónios. Esta conversa dinâmica e bidireccional entre neurónios e astrócitos depende da libertação de NT e GT que são reconhecidos por ambos os tipos de células. Desta forma, a libertação de NT do terminal pré-sináptico afecta o terminal pós-sináptico mas também os astrócitos envolventes, induzindo um aumento nos seus níveis intracelulares de Ca2+ [Ca2+]i. Em resposta, os astrócitos libertam GT, por um mecanismo não complemente elucidado, afectando novamente o terminal pós-sináptico e ainda a libertação de NT do terminal pré-sináptico. Através destes mecanismos, os astrócitos modulam a excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica, havendo evidências de que também modulam fenómenos como a potenciação de longa duração que está intimamente ligada à memória e aprendizagem. As purinas, nomeadamente o ATP e a adenosina, modulam a gliotransmissão, regulando a transmissão sináptica e a comunicação neurónio-astrócito. O ATP desencadeia a sinalização por Ca2+, sendo um dos agentes dos primeiros eventos no processo de gliotransmissão em astrócitos. O aumento da [Ca2+]i mediado pelo ATP deve-se à activação de receptores metabotrópicos (P2YR), que levam à libertação de Ca2+ dos compartimentos intracelulares via fosfolipase C (PLC) e inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3), e de receptores ionotrópicos (P2XR), que medeiam a entrada directa de Ca2+ do exterior da célula. O ATP é convertido extracelularmente em adenosina e ambas as purinas se acumulam simultânea ou sequencialmente, estando os seus níveis aumentados em situações patológicas. Os receptores para o ATP (metabotrópicos P2YR e ionotrópicos P2XR) e para a adenosina (metabotrópicos A1R, A2AR, A2BR e A3R) são coexpressos nos astrócitos, o que sugere uma possível interacção entre estas duas famílias de receptores. Da família dos receptores de ATP, o P2Y1R exerce um papel preponderante no desencadear da gliotransmissão. Sabe-se que a adenosina modula a sinalização de Ca2+ desencadeada por neurotransmissores e neuromoduladores como o glutamato e ATP, no entanto, não se compreende completamente quais os receptores de adenosina envolvidos neste processo. É de salientar ainda que os receptores A1 estão negativamente acoplados ao AMP cíclico (cAMP) através de uma proteína Gi inibitória, diminuindo a libertação de GT. Os receptores A2A estão positivamente acoplados ao cAMP através de uma proteína Gs estimuladora, potenciando a libertação de GT. Estudos anteriores mostram que a adenosina modula diferencialmente a internalização de GABA em astrócitos corticais através dos seus receptores membranares de alta afinidade A1 e A2A. É de salientar que esta modulação depende da cooperação entre os receptores A1 e A2A. O principal objectivo deste trabalho é avaliar o papel dos receptores de adenosina, em particular do A2A, na modulação da sinalização por Ca2+. Pretende-se também explorar a possível cooperação entre os receptores A1 e A2A de adenosina no efeito modulatório. As respostas de Ca2+ em astrócitos corticais primários foram estudas pela técnica de imagiologia de Ca2+, usando um microscópio invertido de epifluorescência. O fluoróforo escolhido foi o Fura-2AM que é altamente sensível ao Ca2+, ligando este ião de forma estável e reversível. Trata-se de um fluorocromo raciométrico, uma vez, que sofre um desvio no comprimento de onda do pico de absorvência quando ligado ao Ca2+, de 380 (F380) para 340 (F340) nm. O rácio F340/F380 é usado para avaliar as variações da [Ca2+]i. A internalização do fluoróforo processa-se durante 45 minutos a 37oC e ocorre de forma passiva devido aos grupos AM que atribuem carga global negativa. Já dentro da célula, os grupos AM são clivados por enzimas e o fluoróforo fica retido no interior da célula. As células foram local e brevemente (0,2 segundos) estimuladas com 10 μM ATP, a 22 oC, e a amplitude das respostas foi medida na presença de diferentes fármacos. Foi usado um análogo estável da adenosina, 2-cloroadenosina (CADO), um agonista e um antagonista selectivos para o receptor A2A, CGS 21680 e SCH 58261, respectivamente, e um antagonista selectivo para o receptor A1, DPCPX. No protocolo desenvolvido e optimizado no decurso do projecto, as células foram estimuladas de 5 em 5 minutos e obteve-se respostas para a situação controlo, apenas com tampão HEPES no meio, de seguida na presença do fármaco, que é mantido no meio de perfusão no mínimo durante 15-20 minutos, seguindo-se finalmente a lavagem com tampão HEPES ou com uma mistura de agonista/antagonista do receptor. Como controlo interno, foi ainda obtida a resposta máxima da célula a um estímulo supramáximo, 100 μM ATP. O desenvolvimento deste protocolo dependeu da optimização de uma serie de parâmetros como o período de intervalo entre estimulações, a concentração de ATP usada como estimulo, a duração de cada estimulação, a temperatura da incubação com o fluoróforo e a temperatura de perfusão usada durante toda o registo de sinais de Ca2+. As culturas primárias foram caracterizadas quanto às populações de células presentes, astrócitos, neurónios e micróglia, pela técnica de imunocitoquímica, recorrendo a anticorpos que marcam especificamente estas células. Detectou-se ainda a presença dos receptores de ATP, P2Y1, e de adenosina, A1 e A2A, pela técnica de western blot, aplicando anticorpos específicos para estas proteínas. Observei que a estimulação breve com 10 μM ATP (0,2 segundos) induz um transiente de Ca2+ rápido. A estimulação prolongada (≥ 20 segundos) com ATP induz uma resposta de Ca2+ bifásica, constituída por um pico inicial, seguindo-se um patamar na resposta. Segundo outros autores, o pico inicial é mediado por receptores P2Y e o patamar por receptores P2X. O envolvimento dos receptores P2Y no pico inicial foi comprovado na presença de baixa concentração de Ca2+ extracelular. O análogo estável da adenosina que apresenta afinidade semelhante para os receptores A1 e A2A, 1 μM CADO, potenciou marcadamente a resposta de Ca2+ desencadeada pelo ATP (aumento da resposta: 3,19 ± 0,30 vezes, n=72 células). O agonista selectivo para o receptor A2A, 30nM CGS 21680, imitou este efeito (2,92 ± 0,32 vezes, n=80 células). Estes efeitos foram completamente revertidos após remoção do agonista do meio de perfusão. O parâmetro ‘aumento da resposta’ é o rácio entre a amplitude da resposta ao ATP na presença do fármaco e a amplitude da resposta na ausência de fármaco. Foi ainda calculado o parâmetro ‘resposta controlo/resposta máxima’, tendo observado uma relação inversa entre os valores de aumento de resposta e resposta controlo/resposta máxima. Desta forma, as células que apresentam uma menor resposta controlo em relação à resposta máxima, determinada na presença de 100 μM ATP, sofrem um aumento mais elevado induzido pelos agonistas, CADO e CGS 21680. Tal variabilidade de respostas mostra que estamos perante uma população de células heterogéneas. Para estudar a possível cooperação e/ou interacção entre os receptores A1 e A2A, foram usados antagonistas específicos para estes receptores de forma a testar se revertiam a potenciação induzida pelos agonistas. Verifiquei que os antagonistas, 50 nM SCH 58261 e 50 nM DPCPX, por si só, não induziam variação apreciável na resposta de Ca2+. Surpreendentemente, a potenciação induzida pelo CADO (agonista não-selectivo A1 e A2A) e pelo CGS 21680 (agonista selectivo A2A) foi completamente revertida não só pelo antagonista específico do receptor A2A, SCH 58261, mas também pelo antagonista específico do receptor A1, DPCPX. Tais resultados mostram que a activação de ambos os receptores, A1 e A2A, é fundamental para que o efeito modulatório se verifique, sugerindo a cooperação entre estes receptores. A caracterização das culturas primárias pela técnica de imunocitoquímica mostrou que estas são constituídas maioritariamente por astrócitos (> 90%) e alguma micróglia. Desta forma, pode-se afirmar que estamos perante culturas primárias enriquecidas em astrócitos. A introdução de um passo extra de agitação ao dia 6 de cultura, antes de replaquear as células, permite obter culturas com uma maior percentagem de astrócitos (> 95%) em relação à micróglia. Recorrendo à técnica de western blot foi possível detectar a presença dos receptores de ATP, P2Y1, e de adenosina, A1 na cultura enriquecida em astrócitos. No entanto, usando esta técnica, não foi possível detectar os receptores A2A de adenosina. Uma vez, que a presença de receptores A2A já foi observada anteriormente em astrócitos corticais e que pela técnica de imagiologia de Ca2+, aqui aplicada, foram obtidas respostas a fármacos específicos para estes receptores, pode-se afirmar que estes receptores estão presentes nas culturas primárias usadas neste estudo. Provavelmente a sua densidade será baixa e desta forma difícil de quantificar por western blot. Os resultados aqui apresentados permitem concluir que a adenosina, através da activação de receptores A2A, facilita a sinalização por Ca2+ induzida pelo ATP, em astrócitos corticais. Mais ainda, a cooperação entre os receptores A1 e A2A, parece ser essencial para a modulação observada. O envolvimento de receptores A2A na modulação da sinalização de Ca2+ aqui demonstrado contrapõe resultados anteriores nos quais outros autores mostraram que estes receptores não tinham qualquer efeito sobre a modulação das respostas de Ca2+. Esses autores mostraram ainda que os receptores A2B de adenosina medeiam a modulação da sinalização por Ca2+. No entanto, no trabalho anterior foram usadas concentrações de fármacos não selectivas para os receptores correspondentes, o que poderá justificar as diferenças nos resultados obtidos. Os resultados aqui apresentados estão de acordo com o modelo tetramérico - A1-A1-A2A-A2A - de receptores de adenosina proposto para a modulação diferencial da internalização de GABA pela adenosina, em astrócitos corticais. Os resultados aqui obtidos apoiam um cenário semelhante para a modulação da sinalização de Ca2+ pela adenosina com possíveis implicações na libertação de GT. Trata-se por isso de um novo mecanismo de modulação sináptica indirecto que é provavelmente mediado pela cooperação dos receptores A1 e A2A de adenosina, permitindo uma regulação apertada e uma transição suave entre os estados inibitório e potenciador.; Purines, namely ATP and adenosine, modulate gliotransmission, regulating synaptic transmission and ultimately neuron-astrocyte communication. ATP triggers the signalling of free calcium ions (Ca2+), which is the substrate for gliotransmission, in astrocytes. ATP is extracellularly converted into adenosine and both purines can be accumulated simultaneously or sequentially, acting on a plethora of membrane astrocytic receptors. Adenosine modulates GABA uptake in cortical astrocytes through A1 (A1R) and A2A (A2AR) receptors. Most importantly, this modulation is dependent on tight A1R-A2AR cooperation. Therefore, the aim of this project was to evaluate the role of adenosine receptors, mainly A2AR, in Ca2+ signalling modulation and also to explore the possible cross-talk between A1R and A2AR in this modulation. Ca2+ responses of cortical primary astrocytes were studied by Ca2+ imaging technique using Fura-2AM, at 22oC. Cells were locally and briefly (0.2 seconds) stimulated with 10μM ATP and the amplitude of fluorescence signals was measured in the presence of different drugs. Cultures were further characterized by immunocytochemistry and western blot techniques. A stable adenosine analogue, 2-Chloroadenosine (1 μM), markedly enhanced ATP-induced Ca2+ responses (fold increase: 3.19 ± 0.30, n=72 cells). An A2AR selective agonist, CGS 21680 (30nM), mimicked this effect (2.92 ± 0.32, n=80 cells). The potentiation mediated by both agonists was not only completely reverted by an A2AR selective antagonist, SCH 58261 (50nM), but also by an A1R selective antagonist, DPCPX (50nM). Primary enriched astrocytic cultures are constituted mainly by astrocytes (> 90%) and microglial cells. The presence of ATP, P2Y1R, and adenosine, A1R, but not A2AR could be demonstrated for primary astrocytic cultures. Nevertheless, selective agonists and antagonist used in Ca2+ imaging have proven the presence of functional A2AR. It is concluded that adenosine, through A2AR activation, potentiates ATP-induced Ca2+ signalling in astrocytes. Furthermore, A1R-A2AR cooperation seems to be required for this modulation. Description: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011

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