http://hdl.handle.net/10451/51 2013-05-24T01:02:47Z 2013-05-24T01:02:47Z Violante, Sara Liliana Nunes, 1983- http://hdl.handle.net/10451/8341 2013-04-19T11:52:55Z 2013-01-01T00:00:00Z

Title: Novel aspects of carnitine function and metabolism Authors: Violante, Sara Liliana Nunes, 1983- Abstract: Normal functioning of fatty acid oxidation and energy metabolism depends on carnitine. Although this compound has been extensively studied over the years, some aspects of carnitine metabolism and function remain unclear. This thesis aimed to: 1) elucidate the reverse action of the carnitine shuttle in the mitochondrial detoxification of intermediates accumulating in mitochondrial fatty acid β-oxidation (mFAO) and branched-chain amino acid (BCAA) oxidation disorders; 2) shed light on how acylcarnitine intermediates cross the outer mitochondrial membrane; 3) clarify the contribution of peroxisomes to the oxidation of medium-chain fatty acids when the carnitine shuttle is impaired, and 4) give a new insight on the importance of carnitine and the carnitine biosynthesis pathway in autism spectrum disorders. Deficiencies in the mFAO or BCAA oxidation pathways generally lead to the intramitochondrial accumulation of acyl-coenzyme A (CoA) esters. These acyl-CoAs are potentially toxic to the mitochondria and to the cell and are, therefore, readily conjugated with other molecules and converted into compounds that can then undergo mitochondrial and cellular export. The production of acylcarnitines is one of the mechanisms used to detoxify the mitochondria and the cell from the accumulating acyl-CoAs. Using in vitro techniques we have thoroughly studied the substrate specificity of two acyltransferases generally assumed to be responsible for the mitochondrial synthesis of acylcarnitines. We have shown that carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT2) and carnitine acetyltransferase are responsible for the production of most of the acylcarnitines commonly found in mFAO disorders or deficiencies affecting the BCAA oxidation. Furthermore, we observed that trans-2-enoyl-CoAs are poor substrates for both acyltransferases and even act as CPT2 inhibitors, possibly by interfering with the catalytic mechanism of the enzyme. This may explain not only the absence of some of the respective trans-2-enoyl-carnitine intermediates from plasma acylcarnitine profiles of patients affected with a mFAO or BCAA oxidation disorder, but also the severity associated with such pathologies, as trans-2-enoyl-CoAs may additionally interfere with the metabolism of other compounds. It was also important to clarify the mechanism by which acylcarnitnes are exported to the cytosol and out of the cell. Using cell lines with deficiencies in specific proteins associated with the carnitine transport and in the presence and absence of a deficiency in the medium-chain acyl-CoA dehydrogenase enzyme, induced by gene silencing, we have confirmed the in vitro results obtained for recombinant CPT2 and showed that, in intact cells, CPT2 is responsible for the production of medium-chain acylcarnitines. Moreover, we also observed that carnitine/acylcarnitine translocase (CACT) is the protein responsible for the mitochondrial export of medium-chain acylcarnitines (through the inner mitochondrial membrane) and that the cellular export of these intermediates does not seem to rely on the plasma membrane carnitine transporter, OCTN2. In the same context, the mechanism by which acylcarnitines cross the outer mitochondrial membrane (OMM) is still far from being elucidated. It has been suggested that carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) forms oligomeric complexes in the OMM. This would result in the formation of a hexameric structure that could function as a pore, facilitating the transport of acylcarnitines across the OMM. We have demonstrated that CPT1 does not seem to be crucial in the passage of acylcarnitines through the OMM for further oxidation within the mitochondria, or at least this is not the exclusive route for the access of acylcarnitines to the intermembrane space. It is generally assumed that medium-chain fatty acids (MCFAs) are oxidized in mitochondria independently from carnitine. However, the true contribution of the carnitine shuttle to the oxidation of MCFAs has remained elusive. We show that lauric acid, a MCFA, also depends on the carnitine shuttle to be fully oxidized in the mitochondria. Furthermore, we observed that when the carnitine shuttle is impaired, this MCFA is able to undergo one or two cycles of peroxisomal β-oxidation. This shows that peroxisomes may have a more prominent role than earlier assumed in the oxidation of straight-chain fatty acids which are not typically metabolized in this cellular compartment, potentially acting as a compensatory mechanism when mFAO is compromised. Finally, we show that carnitine and its biosynthetic pathway may have an important role in neurologic development. In patients with non-dysmorphic autism, we found a common deletion in exon 2 of the TMLHE gene, encoding the first enzyme of the carnitine biosynthesis pathway, trimethyllysine dioxygenase. This leads to the absence of protein and accumulation of trimethyllysine in the plasma and urine of patients. We have therefore characterized the first inborn error of carnitine biosynthesis and found that this defect is associated with non-dysmorphic autism. This suggests that TMLHE deficiency may be a risk factor for the development of autism spectrum disorders and that the maintenance of a proper carnitine homeostasis during development may be particularly important in these patients. Altogether, the results obtained provide new insights on the function and metabolism of carnitine in health and disease. We established the origin and export route of the acylcarnitines that appear in the plasma of patients with mFAO or BCAA oxidation deficiencies and showed that CPT1 does not seem to be crucial for the mitochondrial import of these carnitine derivatives. We have also observed that the carnitine shuttle has a greater contribution to the oxidation of MCFAs than previously expected and that peroxisomes are able to oxidize these fatty acids in cases of mFAO impairment. Moreover, a new inborn error of metabolism is described in the carnitine biosynthesis pathway being its implications in autism spectrum disorders thoroughly discussed.; A carnitina (ou L-carnitina) é um composto crucial no metabolismo energético. No Homem, grande parte da carnitina é proveniente da dieta, nomeadamente através da ingestão de carne e outros produtos de origem animal. No entanto, o organismo tem a capacidade de produzir carnitina endogenamente, um processo do qual indivíduos estritamente vegetarianos dependem para a obtenção de níveis adequados deste composto. A carnitina tem um papel fundamental no transporte de ácidos gordos de cadeia longa do citosol para a mitocôndria, local onde ocorre a β-oxidação. Apesar da carnitina ser um composto amplamente estudado ao longo dos anos, alguns aspetos relativos ao seu metabolismo e função permanecem pouco claros. Assim, estudos planeados durante esta tese tiveram como objetivos: 1) elucidar a ação do ciclo da carnitina na eliminação de intermediários tóxicos que se acumulam em doenças da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos e do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada, numa função inversa à do seu mecanismo fisiológico; 2) aprofundar o conhecimento acerca do mecanismo de translocação de acilcarnitinas através da membrana externa da mitocôndria; 3) clarificar a contribuição dos peroxissomas para a oxidação de ácidos gordos de cadeia média em casos de deficiência do ciclo da carnitina; 4) proporcionar uma nova perspetiva sobre a importância da carnitina e da sua biossíntese em perturbações do espetro do autismo. As deficiências na β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos ou no metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada levam, em geral, à acumulação intramitocondrial de ésteres de acil-coenzima A (acil-CoAs). Estes metabolitos são potencialmente tóxicos e, como tal, são degradados em vias alternativas tais como a ω e ω-1 oxidação, levando à produção de ácidos dicarboxílicos e/ou conjugação com outras moléculas sendo convertidos em acilglicinas ou acilcarnitinas, compostos que podem ser mais facilmente exportados da mitocôndria e da célula. A produção de acilcarnitinas é um dos mecanismos usados para a eliminação mitocondrial e celular dos acil-CoAs que se acumulam devido ao bloqueio enzimático. A especificidade de substrato das duas aciltransferases, tidas geralmente como responsáveis pela síntese mitocondrial de acilcarnitinas, foi extensivamente estudada usando técnicas in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que as enzimas carnitina palmitoiltransferase 2 (CPT2) e carnitina acetiltransferase são responsáveis pela produção de grande parte das acilcarnitinas encontradas no plasma de doentes com défices ao nível da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos e do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada. Por outro lado, verificou-se que os intermediários trans-2-enoil-CoAs não são bons substratos para estas aciltransferases, actuando mesmo como inibidores da CPT2. Esta inibição poderá dever-se a uma interferência destes compostos com o mecanismo catalítico da enzima. Estes dados poderão explicar, não só a ausência de trans-2-enoilcarnitinas nos perfis metabólicos em alguns casos de defeitos genéticos ou adquiridos onde se prevê a acumulação dos respetivos ésteres de CoA, mas também a gravidade de algumas destas patologias, uma vez que os trans-2-enoil-CoAs poderão ainda interferir com o metabolismo de outros compostos. De modo a confirmar os estudos in vitro e a clarificar o mecanismo de exportação de acilcarnitinas para o citosol e para o plasma, recorreu-se ao uso de linhas celulares deficientes em proteínas específicas associadas ao transporte de carnitina com e sem silenciamento do gene que codifica para a desidrogenase dos ésteres acil-CoA de cadeia média. Desta forma, foi possível induzir a acumulação intramitocondrial de acil-CoAs, confirmando os resultados obtidos anteriormente para a CPT2. Demonstrou-se que na ausência desta enzima não há produção de acilcarnitinas de cadeia média após a acumulação do respetivo acil-CoA dentro da mitocôndria. Os resultados demonstraram ainda que o transportador carnitina/acilcarnitina translocase (CACT) é responsável pela exportação mitocondrial de acilcarnitinas de cadeia média através da membrana interna da mitocôndria e que a exportação celular destes intermediários não parece depender do transportador de carnitina da membrana plasmática, OCTN2. Do mesmo modo, o mecanismo pelo qual as acilcarnitinas atravessam a membrana externa da mitocôndria permanece por elucidar. Estudos apresentados na literatura sugerem que a enzima carnitina palmitoiltransferase 1 (CPT1) tem a capacidade de se organizar em estruturas oligoméricas que conduzem à formação de complexos hexaméricos na membrana externa da mitocôndria. É ainda sugerido que esta potencial oligomerização da proteína origina uma estrutura semelhante a um poro que poderá facilitar o transporte de acilcarnitinas através da membrana externa da mitocôndria. Os resultados obtidos durante este trabalho revelaram, contudo, que a CPT1 não parece ser crucial na passagem de acilcarnitinas através da membrana externa da mitocôndria para posterior oxidação na matriz mitocondrial ou, pelo menos, esta não parece ser uma via exclusiva para o acesso das acilcarnitinas ao espaço intermembranar. O papel dos peroxissomas na oxidação de ácidos gordos de cadeia linear média ou longa não é claro. É geralmente aceite que estes substratos são totalmente oxidados na mitocôndria. Em particular, assume-se que os ácidos gordos de cadeia média entram na mitocôndria essencialmente por difusão, ao contrário dos ácidos gordos de cadeia longa que requerem o ciclo da carnitina para aceder à matriz mitocondrial. Os dados obtidos demonstraram que o ácido láurico, normalmente assumido como sendo um ácido gordo de cadeia média, também depende do ciclo da carnitina para ser completamente oxidado na mitocôndria. Adicionalmente foi observado que, em casos de deficiência nas proteínas que compõem o ciclo da carnitina, o ácido láurico é direcionado para os peroxissomas sofrendo pelo menos um ciclo de β-oxidação peroxissomal. Estes resultados sugerem que, ao contrário do que tem sido aceite pela comunidade científica, os peroxissomas têm uma função importante na oxidação de ácidos gordos que não são tipicamente oxidados neste compartimento celular, podendo actuar como um mecanismo compensatório quando a β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos está comprometida. Por fim, foi demonstrado que a carnitina e a sua biossíntese podem ter um papel relevante em distúrbios neurológicos. Em doentes com autismo não-dismórfico foi encontrada uma deleção no exão 2 do gene TMLHE, que codifica para a primeira enzima da biossíntese da carnitina, a dioxigenase da trimetil-lisina. Esta deleção conduz à ausência de proteína, bem como à acumulação de trimetil-lisina e deficiência em γ-butirobetaína no plasma e na urina dos doentes. Deste modo, os resultados obtidos permitiram a caracterização do primeiro erro hereditário da biossíntese da carnitina. Foi ainda observada uma associação desta deficiência genética ao nível do gene TMLHE com o autismo não-dismórfico. Estes dados indicam que a deficiência em TMLHE pode ser um fator de risco para o desenvolvimento de doenças do espetro do autismo e que a manutenção da homeostase da carnitina durante o desenvolvimento pode ser particularmente importante nestes doentes. De um modo geral, os resultados obtidos durante este trabalho proporcionam uma nova perspetiva sobre a função e o metabolismo da carnitina em situações fisiológicas ou em casos de doença. Foi possível estabelecer a origem das acilcarnitinas presentes no plasma de doentes com alterações genéticas ou adquiridas da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos ou do metabolismo dos aminoácidos ramificados e demonstrou-se que a CPT1 não parece ser crucial para a importação mitocondrial destes metabolitos. Observou-se ainda que o ciclo da carnitina apresenta um papel mais importante na oxidação dos ácidos gordos de cadeia média do que até agora assumido e que os peroxissomas podem actuar como um mecanismo compensatório nos casos em que a β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos está comprometida, aceitando como substratos ácidos gordos que não podem ser oxidados na mitocôndria. Por fim, a descoberta de um novo erro hereditário da biossíntese da carnitina permite refletir sobre as suas implicações em perturbações do espetro do autismo. Description: Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013

2013-01-01T00:00:00Z Nunes, Maria João de Jesus, 1982- http://hdl.handle.net/10451/8071 2013-03-26T10:36:19Z 2012-01-01T00:00:00Z

Title: Transcriptional regulatory mechanisms involved in CYP46A1 up-regulation by histone deacetylase inhibitors:from chromatin structure to transcription factors Authors: Nunes, Maria João de Jesus, 1982- Abstract: Apart from being an essential component of cellular membranes and having a role as a signaling molecule, cholesterol is also the precursor of several bioactive molecules that include bile acids, steroid hormones, oxysterols and vitamin D. In the brain constant levels of this sterol are required for normal functioning and the homeostasis is maintained, in part, by an efficient blood-brain barrier that prevents exchanges with lipoprotein cholesterol from circulation. For that reason, de novo and in situ synthesis occur to meet cholesterol needs in the central nervous system (CNS), which despite the low synthesis rate must be excreted at some degree in order to keep its steady state. The conversion of cholesterol into 24(S)-hydroxycholesterol, by the neuronalspecific cytochrome P450 cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1) has been described as the major elimination mechanism. The main goal of this work was to characterize the effect of histone deacetylase (HDAC) inhibition in the transcriptional regulation of CYP46A1 gene and the molecular mechanism underlying such effect. We started by demonstrating that the inhibition of HDAC activity by trichostatin A (TSA), valproic acid and sodium butyrate cause a potent induction of both CYP46A1 promoter activity and endogenous expression. Indeed, we have shown for the first time that TSA induces an overall increase in histone acetylation levels at CYP46A1 proximal promoter, as a result of the detachment of HDACs and recruitment of histone acetyltransferases (HAT), in a process dependent on Sp3 transcription factor decreased binding to particular cis-elements. This change in chromatin structure culminates in the recruitment of RNA polymerase II and CYP46A1 gene activation. Nevertheless, the fact that histone deacetylation was evident at a time point when the HDAC/HAT ratio should still favor acetylation, led us to investigate if mechanisms besides histone hyperacetylation could participate in the TSA mediated derepression of CYP46A1 gene. Interestingly, we identified the participation of the mitogen-activated kinase kinase (MEK)-extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway in the CYP46A1 response to TSA. A decrease in ERK1/2 phosphorylation levels was observed after TSA treatment concomitantly with a decrease in Sp3 binding activity. Inhibition of protein phosphatase activity by pre-treatment with okadaic acid (OA) completely reversed these changes, and impaired the TSA-mediated CYP46A1 activation without affecting promoter histone hyperacetylation. Our results also show that TSA treatment induces the dissociation of phosphorylated ERK1/2 from the CYP46A1 promoter and specifically from the Sp3-containing DNA fragments. This suggests that in the context of the CYP46A1 promoter phosphorylated Sp3 acts as a transcriptional repressor being responsible for the recruitment of co-repressor complexes, with and without HDAC activity. Moreover, our work highlights the importance of the MEK-ERK signaling pathway in the control of brain cholesterol elimination. The importance of CYP46A1 in cholesterol homeostasis and the drastic effect of HDAC inhibitors (HDACi) in its expression, lead us to evaluate if these compounds can affect the expression of other key players in neuronal cholesterol metabolism. In the last part of our work we have identified TSA as a cholesterol-lowering molecule, by modulating the transcription of other genes involved in cholesterol metabolism in human neuroblastoma cells, namely by up-regulating genes that control cholesterol efflux and dow-regulating genes involved in cholesterol synthesis and uptake, thus leading to an overall decrease in total cholesterol content. Moreover, we have shown that TSA is also able to partially reverse the increased cholesterol content and the transcriptional changes, induced by pathological lysosomal accumulation of intracellular cholesterol. Overall, these results clarify the role of HDACi in the modulation of CYP46A1 gene transcription as well as other key genes in cholesterol metabolism, comprising a significant contribution in the elucidation of the molecular mechanism involved in the transcriptional regulation of CYP46A1 gene and emphasizing the idea of HDAC inhibition as a promising therapeutic tool in neurodegenerative disorders with impaired cholesterol metabolismo.; O colesterol é uma molécula essencial à vida. Para além de desempenhar um papel crucial na estrutura das membranas celulares, através da regulação da permeabilidade e fluidez das mesmas, o colesterol é também percursor de inúmeras moléculas de extrema relevância biológica tais como os ácidos biliares, os oxisteróis, as hormonas esteroides e a vitamina D, podendo também atuar como uma molécula sinalizadora. No encéfalo, o colesterol está maioritariamente na forma não esterificada e encontra-se associado às bainhas de mielina e às membranas plasmáticas dos neurónios e células da glia. O colesterol é também essencial à formação e propagação de sinapses, ao crescimento dendrítico e à estabilidade dos microtúbulos. Além disso, o sistema nervoso central (SNC) necessita de níveis constantes de colesterol para um correto funcionamento, sendo que a homeostasia é assegurada, em parte, pela barreira hematoencefálica que impede trocas com o colesterol em circulação. Por esta razão, todo o colesterol presente no encéfalo deriva de uma síntese de novo e in situ. Apesar de no SNC do adulto a síntese de colesterol ser reduzida, uma fração necessita de ser excretada, de forma a manter os níveis de colesterol constantes. A conversão do colesterol em 24(S)- hidroxicolesterol, pelo enzima 24(S)-hidroxilase (CYP46A1), foi descrita como o principal mecanismo de eliminação. O produto enzimático (oxisterol), contrariamente ao colesterol, atravessa com facilidade a barreira hemato-encefálica, entra em circulação e é posteriormente eliminado no fígado, completando desta forma o processo de transporte reverso do colesterol. Nos últimos anos, um grande número de estudos aponta para uma relação entre alterações no metabolismo do colesterol e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, a doença de Huntington ou a doença de Niemann-Pick tipo C. Para além disso, inúmeras evidências sugerem que a indução do CYP46A1 poderá ter consequências benéficas, nomeadamente na doença de Alzheimer. De facto a sobre-expressão do CYP46A1 poderá ter um efeito inibitório direto sobre a produção do péptido β-amilóide, um efeito indireto relacionado com a diminuição dos níveis de colesterol das membranas neuronais, ou por aumentar a ativação dos genes alvo do receptor nuclear liver X receptor. O principal objectivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da inibição das desacetilases de histonas (HDAC) na regulação da transcrição do gene CYP46A1, bem como dos mecanismos moleculares subjacentes a esse mesmo efeito. Na primeira parte deste trabalho, começámos por demonstrar que a inibição da atividade das HDACs através do tratamento com os inibidores tricostatina A (TSA), ácido valpróico e butirato de sódio, causam uma drástica indução da atividade do promotor e da expressão endógena do gene CYP46A1. Observámos também, pela primeira vez, que o tratamento com TSA induz um aumento significativo dos níveis de acetilação das histonas do promotor próximo do gene CYP46A1, sendo que este efeito resulta da diminuição da presença de HDACs e do recrutamento de acetiltransferases de histonas (HAT). Estudos anteriores do nosso grupo identificaram como essenciais na expressão basal do gene CYP46A1 factores de transcrição da família Sp e, neste estudo, demonstrámos que as proteínas Sp1 e Sp4 são também cruciais para a ativação do CYP46A1 pelo TSA. No entanto o efeito do TSA parece depender da diminuição da ligação do factor de transcrição Sp3 a elementos de resposta específicos do promotor, uma vez que uma diminuição de ligação desta proteína está relacionada com a diminuição de HDACs presentes no promotor. De uma forma geral, as modificações na estrutura da cromatina e no complexo proteico na região do promotor próximo induzidas pelo TSA culminam no recrutamento da RNA polimerase II e na consequente ativação do gene CYP46A1. A evidência de que o nível de acetilação das histonas a determinado momento não reflete a razão entre os níveis dos enzimas HDAC/HAT presentes no promotor, conduziu-nos à investigação de mecanismos independentes da hiperacetilação de histonas que pudessem contribuir para a ativação do gene CYP46A1 pelo TSA. De facto, na segunda parte do nosso trabalho identificámos a participação da via de sinalização da cinase de proteínas ativada por mitogénios (MAPK) na resposta do CYP46A1 ao TSA. Através do pré-tratamento com inibidores químicos específicos bem como a utilização de dominantes negativos da cinase terminal desta via, a cinase de proteínas regulada por sinais extracelulares (ERK), concluímos que a inibição da atividade deste enzima potencia o efeito do TSA, contrariamente ao efeito da inibição das fosfatases de proteína, através do pré-tratamento com ácido ocadáico, que bloqueia quase na totalidade a ativação do gene CYP46A1 pelo TSA. A análise dos níveis de fosforilação da ERK1/2 demonstrou que o TSA induz uma diminuição do nível de ativação destas cinases, bem como da atividade de ligação da proteína Sp3 ao DNA, efeitos esses que são revertidos pelo pré-tratamento com ácido ocadáico, sem que o nível de hiperacetilação das histonas do promotor seja afetado. Os nossos resultados demonstram ainda que o tratamento com TSA induz a dissociação da forma fosforilada da ERK1/2 do promotor do CYP46A1, especificamente, dos fragmentos de DNA que contêm o factor de transcrição Sp3, sugerindo que no contexto do promotor do CYP46A1 a proteína Sp3 atua como um repressor da transcrição e é responsável pelo recrutamento de complexos co-repressores, com e/ou sem atividade HDAC. O TSA ao modular a ativação da ERK1/2 regula indiretamente a atividade deste factor de transcrição e consequentemente a expressão do CYP46A1. De facto, a replicação do efeito do ácido ocadáico e da inibição da atividade da ERK1/2 na atividade do promotor e expressão basal do gene CYP46A1 evidencia também a importância desta via de sinalização intracelular no controlo da eliminação de colesterol do encéfalo. A importância do CYP46A1 na homeostasia do colesterol bem como o efeito drástico dos inibidores das HDACs na sua expressão, conduziu à avaliação do efeito destes compostos na expressão de genes chave no metabolismo do colesterol em células neuronais. Como tal, na última parte deste trabalho demonstrámos a capacidade do TSA de diminuir os níveis de colesterol em células de neuroblastoma humano, através da regulação da expressão de genes envolvidos no metabolismo do colesterol, nomeadamente, através da indução de genes envolvidos no controlo do efluxo (transportadores ATP-binding cassette) e catabolismo (CYP46A1), e repressão de genes essenciais para a síntese (3-metilglutaril Coenzima A redutase) e captação de colesterol (receptor de lipoproteínas de baixa densidade), culminado desta forma na diminuição do conteúdo total de colesterol. O tratamento com o composto U18666A, que mimetiza o fenótipo da doença de Niemann-Pick tipo C, caracterizado pela acumulação patológica de colesterol nos lisossomas, resultou no aumento dos níveis de colesterol em células de neuroblastoma humano, bem com no aumento da expressão de genes envolvidos na síntese e captação de colesterol e diminuição dos genes responsáveis pelo efluxo. No entanto, o tratamento com TSA reverteu todos esses efeitos, contribuindo para a correção das perturbações no metabolismo do colesterol. Apesar de já ter sido demonstrado o efeito benéfico da inibição das HDACs em fibroblastos de pacientes com a doença de Niemann-Pick tipo C, este trabalho demonstra pela primeira vez a capacidade destes compostos de reverter, ao nível da transcrição, os efeitos da acumulação de colesterol nos lisossomas. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese identificam os inibidores das HDACs como agentes farmacológicos que poderão eventualmente vir a ser usados na indução da transcrição do gene CYP46A1, bem como na modelação da transcrição de genes que participam de forma relevante no metabolismo do colesterol no encéfalo. Para além disso constitui uma contribuição significativa para a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pela regulação da transcrição do gene CYP46A1, identificando a via das MAPKs como umas das vias de sinalização responsáveis pelo controlo do catabolismo do colesterol no encéfalo. A compreensão dos mecanismos moleculares controlados pelos inibidores das HDACs, e envolvidos na homeostasia do colesterol no encéfalo, poderá de facto constituir uma plataforma para o desenvolvimento de possíveis intervenções farmacológicas que vão da neurodegenerescência ao cancro. Description: Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012

2012-01-01T00:00:00Z Mestre, Olga Maria Elviro, 1984- http://hdl.handle.net/10451/7624 2013-02-01T10:04:58Z 2012-01-01T00:00:00Z

Title: Mycobacterium tuberculosis host adaptation and evolution reflected by defense mechanisms against oxidative stress Authors: Mestre, Olga Maria Elviro, 1984- Abstract: Part of the success of Mycobacterium tuberculosis lies in its ability to thrive inside macrophages, where it is exposed to strong antimicrobials molecules, such as reactive oxygen species (ROS). However, the role of defense mechanisms against ROS in M. tuberculosis pathogenesis remains unclear. We used, for the first time, a functional genomic approach to investigate M. tuberculosis responses against ROS. By screening a transposon mutant library we identified a high number of mutants, with increased susceptibility to H2O2, in genes related to cell envelope functions, including mmpL9. This revealed the importance of M. tuberculosis cell envelope against oxidative stress. However, we have also identified genes implicated in other kind of defense mechanism against ROS, such as moaD1. Infection of human macrophages has shown that both mmpL9 and moaD1 have a role in M. tuberculosis intracellular lifestyle, and previous studies suggested the same for several other genes identified during our screening. Therefore, these represent potential virulence factors useful for the development of future anti-tuberculosis strategies. DNA repair, recombination and replication (3R) are important mechanisms in maintaining genome stability by repairing DNA damages, such as those induced by ROS, however, variations on 3R genes potentially increase genomic variability, due to an increase in mutation rates. Thus, analysis of polymorphisms in 3R genes could indicate which strains are more prone to adapt and evolve. We have analyzed polymorphisms in 3R genes in a collection of strains of a successful family of M. tuberculosis strains, the Beijing/W family. Specific 3R polymorphisms were found to characterize particular groups of Beijing/W strains for which a phylogeny was constructed. Certain groups were found to be predominant, suggesting that strains of these genotypes might have some selective advantage. Therefore, particular 3R SNPs may define pathogenic features that have contributed to the evolution of the Beijing/W family.; Mycobacterium tuberculosis, a bactéria responsável pela tuberculose, infecta cerca de 1/3 da população mundial e é responsável pela morte de aproximadamente 1,5 milhões de pessoas por ano. Estes números podem ser explicados, em parte, pela capacidade desta bactéria persistir no interior de macrófagos, num ambiente extremamente agressivo, no qual é exposta a diferentes moléculas antimicrobianas tais como as espécies reactivas de oxigénio. Estas, sendo altamente reativas, causam danos em todo o tipo de moléculas incluindo lípidos, proteínas e DNA. Desta forma, os mecanismos de defesa utilizados pelo M. tuberculosis contra as espécies reativas de oxigénio são sem dúvida importantes para este, porém, o seu papel na virulência e patogénese desta bactéria ainda é pouco claro. O trabalho desenvolvido nesta tese consistiu na investigação dos mecanismos de defesa utilizados pelo M. tuberculosis contra as espécies reactivas de oxigénio. Com este objectivo, realizou-se pela primeira vez, um screening de uma biblioteca de mutantes construída por transposição, na estirpe clinica da família Beijing/W - GC1237, de forma a selecionar mutantes sensíveis a espécies reativas de oxigénio. A análise de cerca de 6000 mutantes permitiu a selecção de 18, sensíveis a peróxido de hidrogénio, para os quais a amplificação e posterior sequenciação do sítio de inserção do transposão levaram à identificação de 11 genes. Verificou-se que grande parte dos genes apresenta funções associadas ao invólucro celular bacteriano, o que revela que o invólucro do M. tuberculosis representa a primeira barreira de defesa contra as espécies reactivas de oxigénio nesta bactéria. O gene mmpL9 foi um dos identificados, cuja proteína se encontra possivelmente envolvida no transporte de lípidos para o invólucro celular. Curiosamente, três mutantes com diferentes mutações neste gene foram seleccionados. Identificaram-se também alguns genes envolvidos noutro tipo de mecanismos tais como, moaD1, envolvido na síntese do cofactor molibdénio. Uma vez que o M. tuberculosis tem de fazer face às espécies reativas de oxigénio no interior de macrófagos, o passo seguinte consistiu em analisar o fenótipo de alguns destes mutantes nestas células. Para o efeito, macrófagos humanos foram infectados com um dos mutantes no gene mmpL9 ou com o mutante no gene moaD1, uma vez que estudos anteriores demonstraram o papel de diferentes MmpLs na virulência desta bactéria e que outros genes envolvidos na síntese do cofactor molibdénio são importantes para a sobrevivência do M. tuberculosis no interior de macrófagos. Em ambos os casos observou-se uma diminuição na capacidade de crescimento destas estirpes no interior destas células, em comparação com a estirpe selvagem. A complementação destas estirpes mutantes restaurou o fenótipo da estirpe selvagem, o que demonstra o papel destes genes no crescimento de M. tuberculosis em macrófagos humanos. Porém, a complementação restaurou apenas parcialmente a sensibilidade destes mutantes às espécies reactivas de oxigénio in vitro, em comparação com a estirpe selvagem. No entanto, mmpL9 e moaD1 deverão ter um papel na resposta às espécies reativas de oxigénio em M. tuberculosis, caso contrário, a complementação não teria restaurado de todo o fenótipo selvagem, nas condições referidas. A comparação da sequência do gene mmpL9 da nossa estirpe selvagem, GC1237, com a estirpe de referência laboratorial, H37Rv, revelou a presença de uma deleção de um nucleótido na posição 218. Contudo, os nossos resultados obtidos a partir da infecção de macrófagos com o mutante mmpL9 e com a mesma estirpe após complementação da mutação sugerem que o gene mmpL9 deverá ser expresso apesar desta deleção. É possível que ocorra uma reniniação da tradução a partir de um codão de iniciação situado a montante da deleção, na posição 258, no gene mmpL9. Para além disso, a complementação do nosso mutante mmpL9 com o respectivo gene da estirpe H37Rv, restaurou apenas parcialmente o fenótipo da estirpe selvagem, GC1237, durante a infecção de macrófagos. Estas observações sugerem que a proteína MmpL9 na estirpe GC1237 poderá ser diferente da existente na estirpe H37Rv. A análise da sequência de todos os genes mmpL existentes no genoma de M. tuberculosis, numa coleção de estirpes que representam diferentes famílias, sugeriu que a deleção identificada poderá realmente ter um efeito na proteína. Verificou-se ainda que esta deleção é aparentemente específica para todas as estirpes modernas da família Beijing. Isto indica que a deleção do nucleótido 218 poderá ter conferido alguma vantagem selectiva a estas estirpes que contribuiu para a sua evolução. Para além de moaD1 e mmpL9, alguns dos outros genes identificados durante o screening como importantes para a resposta de M. tuberculosis às espécies reativas de oxigénio, foram igualmente descritos, em estudos anteriores, como importantes para a capacidade desta bactéria sobreviver intracelularmente. Isto indica uma correlação entre sensibilidade ao stress oxidativo e capacidade de sobreviver ou replicar-se no interior de macrófagos. No entanto, a infecção de macrófagos tratados com inibidores da NADPH oxidase, a enzima que produz as espécies reativas de oxigénio nestas células, com os mutantes nos genes mmpL9 e moaD1, não permitiu confirmar esta hipótese. É possível que estes mutantes sejam sensíveis a outras moléculas antimicrobianas encontradas no interior do macrófago, tais como as espécies reativas de azoto, que, em conjunto com as espécies reativas de oxigénio, são responsáveis pelo crescimento atenuado observado em macrófagos. Em conclusão, este trabalho permitiu a identificação de genes envolvidos na defesa do M. tuberculosis contra as espécies reactivas de oxigénio, os quais aparentam ter igualmente um papel na sobrevivência desta bactéria nas suas células hospedeiras, os macrófagos. Estes genes representam potenciais factores de virulência que poderão ser úteis para o desenvolvimento de futuros antibióticos ou vacinas. Numa segunda parte desta tese, realizou-se uma análise dos polimorfismos existentes em genes de reparação, recombinação e replicação (3R) de DNA numa família específica de estirpes de M. tuberculosis, a família Beijing. Os mecanismos de reparação, recombinação e replicação são extremamente importantes na manutenção da estabilidade genómica, através da reparação de danos causados no DNA, tais como os induzidos pelas espécies reativas de oxigénio. Por outro lado, estes mecanismos podem ser igualmente responsáveis pela introdução de variabilidade genética. Polimorfismos nos genes que codificam para as proteínas envolvidas nestes mecanismos poderão induzir um aumento na taxa de mutação, e consequentemente, a acumulação de mutações vantajosas para as estirpes, como por exemplo, mutações responsáveis pela resistência a antibióticos. Deste modo, a análise de polimorfismos nos genes 3R poderá indicar que estirpes estão mais predispostas a adaptar-se ou evoluir. A família Beijing é uma família de M. tuberculosis que apresenta uma maior virulência e que tem sido identificada um pouco por todo o mundo como estando frequentemente associada a resistência a antibióticos. Deste modo, analisaram-se polimorfismos em genes 3R numa coleção de estirpes Beijing, isoladas em várias partes do mundo. Diferentes polimorfismos foram identificados que permitiram a discriminação de vários grupos, para os quais foi construída uma árvore filogenética. Estes resultados foram congruentes com os resultados obtidos utilizando outros marcadores genéticos, o que significa que as mesmas associações filogenéticas foram obtidas, para a colecção de estirpes utilizada neste estudo, usando polimorfismos nos genes 3R ou outro tipo de marcadores genéticos. Uma grande percentagem das estirpes foi agrupada num dos grupos, Bmyc10, que incluiu estirpes isoladas em diferentes partes do mundo. Um estudo anterior demonstrou que estirpes com características genéticas que definem as deste grupo são igualmente predominantes numa outra região geográfica, não representada no nosso estudo. Em conjunto, estes resultados sugerem que o genótipo das estirpes do grupo Bmyc10 poderá ter-lhes conferido alguma vantagem selectiva que permitiu a sua evolução. Isto é igualmente sugerido num estudo anterior, no qual a caracterização do efeito da mutação no gene mutT2, que caracteriza todas as estirpes do grupo Bmyc10, indica que esta induz uma alteração na função da proteína que pode ser vantajosa para as estirpes que a possuem. Portanto, alguns dos polimorfismos identificados no nosso estudo poderão ter um efeito na função das respectivas proteínas, o que significa que este tipo de análise é importante para compreender o significado dos mesmos. Em conclusão, a análise de polimorfismos em genes 3R demonstrou que diferentes grupos podem ser identificados na família Beijing caracterizados por polimorfismos específicos. Estes podem ter conferido alguma vantagem que permitiu a expansão de certos grupos e contribuiu para a evolução desta família. A análise da variabilidade genética entre estirpes é importante uma vez que estas podem reflectir diferenças patogénicas. Este estudo poderá contribuir para aprofundar os nossos conhecimentos acerca dos mecanismos que determinam o êxito das estirpes da família Beijing. Description: Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012

2012-01-01T00:00:00Z Silva, Isabel Alexandra Caldeira Ribeiro Monge da, 1976- http://hdl.handle.net/10451/7541 2013-01-25T17:50:30Z 2012-01-01T00:00:00Z

Title: Sophorolipids:from biosynthesis to biological activity evaluation Authors: Silva, Isabel Alexandra Caldeira Ribeiro Monge da, 1976- Description: Tese de doutoramento, Farmácia (Biotecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012

2012-01-01T00:00:00Z