http://hdl.handle.net/10451/87 2013-06-19T21:13:30Z 2013-06-19T21:13:30Z Lança, Telma, 1983- http://hdl.handle.net/10451/8636 2013-06-19T15:17:06Z 2013-01-01T00:00:00Z

Title: Resposta dos linfócitos T ɣδ a tumoures:recrutamento, reconhecimento e funções Authors: Lança, Telma, 1983- Abstract: Tumour immunosurveillance postulates that immune cells are able to eliminate transformed cells, as much as they eliminate pathogens or pathogeninfected cells. This theory constitutes the basis of cancer immunotherapy which explores anti-tumour properties of the immune system (both innate and adaptive) for the treatment of human malignancies. T cells are innate-like lymphocytes that account for a small percentage (1- 10%) of human peripheral blood lymphocytes, but represent the majority of T cells in epithelial tissues. Several properties make T cells attractive targets for cancer immunotherapy, namely their MHC-unrestricted cytotoxicity and unique responsiveness to clinical grade available (phospho) agonists. Despite the promise of T cells in cancer immunotherapy, the clinical success has been limited by low percentages of objective responses. This urges more research on the mechanisms that govern the interactions between T cells and tumours. One of the major gaps in the T cell field is the lack of mechanistic knowledge on tumour cell recognition. We decided to analyze which molecules determine haematological tumour recognition by V9V2 T cells, the major T cell subsets in human peripheral blood. We observed widely variable susceptibility of leukaemia and lymphoma cell lines to V9V2 T cell-mediated cytotoxicity. For those tumours that were efficiently targeted by V9V2 T cells, we found that this required the NK receptor NKG2D, but not the signature T cell receptor (TCR). We then analyzed the expression of NKG2D ligands in susceptible or resistant tumour cells lines, and observed that ULBP1 expression (both at the mRNA level and protein level) segregated with susceptible targets. Through a series of loss- and gain-offunction assays, we demonstrated that ULBP1 constitutes a non-redundant determinant of leukaemia and lymphoma cell recognition by human T cells. Importantly, we observed a dramatic heterogeneity of ULBP1 expression in primary samples obtained from leukaemia and lymphoma patients, which can thus contribute to the highly variable outcomes of T cell-based clinical trials in haematological tumours. Another important limitation to the modulation of T cells in cancer immunotherapy is the lack of molecular cues that direct T cell migration to tumours. Given the pivotal role played by chemokines and their receptors in leukocyte migration, we investigated which chemokines could determine T cell recruitment to tumours. We used the “gold standard” pre-clinical transplantable B16 melanoma model and compared chemokine composition of tumour extracts from WT and TCR-deficient mice, and observed an accumulation of the CCR2 ligands, CCL2 and CCL12, in tumour extracts from TCR-deficient animals. Interestingly, the comparison of WT and CCR2-deficient hosts revealed increased tumour growth in CCR2-/- mice. Critically, we showed that tumours from CCR2-/- (as well as CCL2-/-) mice contained significantly less infiltrating T cells compared to WT tumours, whereas other T cell populations, particularly CD4+ and CD8+ T cells, were not affected. We also analysed myeloid populations, namely macrophages, neutrophils and myeloid- derived suppressor cells (MDSCs), and observed that, as expected from previous literature, these leukocyte populations were reduced in tumours from CCR2-/- mice. Considering that myeloid cell infiltration into tumours is usually associated with poor prognosis, it is noticeable that CCR2-/- mice displayed increased tumour growth when compared to WT mice. Furthermore, as TCR-deficient mice also showed increased tumour burden (compared to WT mice), our data suggests a novel protective role for the CCR2/ CCL2 chemokine pathway through the recruitment of cytotoxic T cells. Considering the significant differences between murine and human T cells, and trying to translate these findings into the human setting, we also investigated if human T cells relied on CCR2 for migration. We observed that the V1 subset expresses CCR2 and migrates towards CCL2 in vitro; by contrast with the V2 population that lacks CCR2 expression, even after activation. Moreover, we observed a dramatic variety of CCL2 levels in several cancer types, with some overexpressing and other downmodulating CCL2 when compared to healthy tissue controls. These data collectively highlight the importance of correlating V1 T cell infiltration with CCL2 expression in situ in future cancer clinical studies. While the potent anti-tumour properties of T cells have been widely demonstrated, some recent reports have implied a pro-tumour role for T cells. We therefore set out to investigate which conditions determine the anti- versus protumour properties of T cells. By comparing two different murine tumour models, B16 melanoma and ID8 ovarian carcinoma, we proposed that the pro-tumour role of T cells may be determined by IL-17 production. TCR-deficient mice showed reduced survival (compared to WT) when challenged with B16 tumours, but enhanced survival when challenged with ID8 tumours. We demonstrated an accumulation of IL-17-producing T cells in the peritoneal cavity of ID8 tumour bearing mice that seemed to dominate over anti-tumour IFN-production. Importantly, the major source of IL-17 in the ID8 tumour model were T cells, and these expressed higher levels of IL-17 (on a per cell basis) than their CD4+ T cell counterparts. In summary, in this thesis we have characterized some key features of T cells in tumour immunosurveillance, namely leukaemia/ lymphoma cell recognition; migration and tumour infiltration; and putative pro-tumour properties. We believe these findings make an important contribution to our understanding of T cell function, and may help to improve current cancer immunotherapy protocols based on T cell activation.; A teoria da imunovigilância do cancro postula que as células do sistema imunitário são capazes de eliminar células transformadas, da mesma forma que combatem patogénios e células infectadas por patogénios. Esta teoria constitui a base da imunoterapia do cancro, a qual explora as propriedades anti-tumorais do sistema imunitário (tanto do sistema inato como do adaptativo) no tratamento de doenças malignas. As células T sao linfócitos que constitutem uma pequena percentagem (1- 10%) dos linfócitos periféricos do sangue humano, mas que representam a maioria das células T em tecidos epiteliais. Estas células apresentam algumas propriedades que as tornam uma boa aposta para protocolos de imunoterapia para o cancro, como por exemplo, citotoxicidade independente da apresentação de antigénios por moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC) e reactividade selectiva a fosfoantigénios que podem ser sintetizados em larga escala. Contudo, apesar do entusiasmo inicial, o sucesso clinico do uso de células T tem sido limitado dadas as baixas percentagens de resposta clínica objectiva obtidas. Estes resultados revelam a necessidade de mais investigação acerca dos mecanismos que determinam uma interação produtiva entre células T e células tumorais. Uma das maiores lacunas na biologia das células T são os mecanismos que controlam o reconhecimento de celulas tumorais. Por esse motivo decidimos analisar quais as moléculas envolvidas na deteccão de tumores hematológicos por células V9V2, as quais constituem a maior fracção das células T no sangue periférico humano. Observamos uma grande variabilidade de susceptibilidade de linhas celulares de leucemia e linfoma a citotoxicidade mediada por células V9V2. Verificámos que o receptor NKG2D é necessário, enquanto que o receptor de células T (TCR) é dispensável, para a eliminação de linhas tumorais susceptíveis. Analisámos a expressão de ligandos de NKG2D nas linhas celulares tumorais resistentes e susceptíveis, e observamos que a expressão de ULBP1 (tanto ao nível do mRNA como ao nível da proteína) está associada a tumores susceptíveis. Realizamos ensaios de perda e ganho de função in vitro e concluímos que o ULBP1 e um determinante não redundante do reconhecimento de leucemias e linfomas por parte das células T humanas. De realçar que observamos uma grande heterogeneidade de expressão de ULBP1 em amostras primárias de doentes de leucemia e linfoma, o que poderá contribuir para a variabilidade de respostas observadas em ensaios clínicos hematológicos baseados em células T Outro aspeto limitante para o sucesso da utilização de células T na imunoterapia do cancro, e a falta de conhecimento dos fatores que controlam a migração e infiltração tumoral das células T . Dado o papel fulcral das quimiocinas e dos seus receptores na migração de leucócitos, investigamos o seu envolvimento o recrutamento tumoral das células T . Usamos o modelo murino pré-clínico de melanoma, baseado na injecçãoa da linha tumoral B16, e comparamos a composição de quimiocinas em extratos proteicos de tumores provenientes de murganhos suficientes (“selvagens”) ou deficientes em linfócitos T (Tcrd-/-), tendo observado uma acumulação de ligandos de CCR2 (CCL2 e CCL12) em extratos tumorais de animais Tcrd. Curiosamente, verificamos também que os murganhos Ccr2-/- apresentavam tumores maiores do que os murganhos selvagens. Analisamos a composicao leucócitaria e concluimos que os tumores de murganhos Ccr2-/- e também de murganhos Ccl2-/- continham significativamente menos células T infiltrantes do que os murganhos selvagens. Verificamos também que a migração de outras populações de linfócitos T, nomeadamente células CD4+ ou CD8+, não foram afetadas. Analisamos as populações mielóides, incluindo macrófagos, neutrófilos e “myeloid-derived suppressor cells” (MDSCs), e observamos (como previsto na literatura) que estas populações leucocitárias se encontravam reduzidas em tumores originários de murganhos Ccr2-/-. Considerando que a infiltração de tumores por células mielóides está geralmente associada com mau prognóstico, é notável que os murganhos Ccr2-/- apresentem tumores maiores em comparação com murganhos selvagens. Adicionalmente, como os murganhos Tcrd-/- também apresentaram tumores aumentados (em comparação com murganhos selvagens), os nossos dados sugerem uma nova função protetora da via inflamatória CCR2/CCL2 através do recrutamento de células T citototóxicas. Dadas as diferenças significativas entre células T de murganho e humanas, e no sentido de aplicar estas descobertas a medicina, investigamos se as células T humanas dependiam de CCR2/CCL2 para a sua migração. Verificamos que a subpopulacao V1 expressa CCR2 e migra para CCL2 in vitro; pelo contrario, a subpopulação V2 não expressa CCR2 (mesmo após ativação)e não responde a CCL2. Adicionalmente, observamos uma grande variabilidade de níveis de expressão de CCL2 em vários tipos de tumores humanos; alguns tipos sobrexpressam, enquanto que outros subexpressam CCL2 comparativamente com os respetivos tecidos saudáveis. Estes dados salientam a importância de correlacionar a infiltração de células T V1 com a expressão de CCL2 in situ em ensaios clínicos futuros. Apesar das potentes propriedades anti-tumourais das células T estarem bem estabelecidas, alguns estudos recentes reportaram uma atividade pro-tumoral das células T Consequentemente, proposemo-nos investigar as condições que determinam as propriedades anti- ou pro-tumorais das células T . Através da comparação de dois modelos murinos de melanoma (linha B16) e de carcinoma do ovário (linha ID8), mostramos que o efeito pro-tumoral das células T se associa a elevada produção de produção de interleucina-17 (IL-17). Verificamos que murganhos Tcrd-/- apresentam sobrevivência reduzida (comparado com murganhos selvagens) apos transplante do tumor B16, mas sobrevivência aumentada após transplante do tumor ID8. A acumulação de células T produtoras de IL-17 exclusivamente na cavidade peritoneal de murganhos transplantados com tumores ID8, levou-nos a propor um efeito pro-tumoral dependente de IL-17. É importante notar que a maior fonte de IL-17 nos tumores ID8 foram as células T e estas que estas expressaram níveis mais elevados de IL-17 (ao nível de cada célula) em comparação com as células T CD4+. Resumindo, nesta tese caracterizamos vários aspetos-chave da resposta das células T a tumores , nomeadamente o reconhecimento molecular de linfomas e leucemias; os mecanismos de migração e infiltração tumoral; e possíveis propriedades pro-tumorais. Acreditamos que estas descobertas contribuem significativamente para o conhecimento da biologia das células T , e esperamos que possam melhorar os protocolos atuais de imunoterapia do cancro baseados da ativação de células T  Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Imunologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013

2013-01-01T00:00:00Z Pereira, Diogo da Fonseca, 1986- http://hdl.handle.net/10451/8635 2013-06-19T14:25:15Z 2013-01-01T00:00:00Z

Title: Role of the neurotrophic factor receptor RET in haematopoiesis Authors: Pereira, Diogo da Fonseca, 1986- Abstract: Haematopoiesis is a developmental process that ensures the generation of all blood cell lineages throughout life. As a consequence, this is a highly complex and dynamic developmental cascade subject to tight regulatory mechanisms. Thus, the study of novel molecular signals is critical to further understand how haematopoiesis operates to ensure the balance between cell lineage commitment, cell homeostasis and efficient haematopoietic responses to insults and disturbances. The tyrosine kinase RET is the receptor for the GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) neurotrophic factor family (GDNF family ligands – GFLs). Productive RET signalling controls the development and maintenance of the enteric nervous system, kidneys and spermatogenesis. Interestingly, Ret expression was detected in haematopoietic cells and lymphoid organs and RET signalling was shown to regulate enteric lymphoid organogenesis. However the role of RET in haematopoiesis remains completely unexplored. Haematopoietic stem cells (HSCs) are at the onset of the developmental cascade that generate all blood cells, thus we initially investigated the role of RET in HSC function and how modulation of RET signalling can be used to control HSC responses. Finally, we investigated the role of RET in late stages of haematopoietic cell precursor differentiation into the T cell lineage. We found that the tyrosine kinase RET is critical to HSC survival and function. HSCs express RET signalling molecules and HSCs microenvironment provides RET ligands. Moreover Ret ablation leads to reduced HSC numbers and recruitment of quiescent cells into proliferation. Although RET null progenitors have normal differentiation potential, they exhibit impaired in vivo stress response and reconstitution potential. Remarkably RET downstream signalling results in p38/MAP kinase phosphorylation and CREB transcription factor activation, providing HSCs with critical surviving cues. In agreement, recue of Ret null progenitors was efficiently achieved in vivo by forcing the expression of RET downstream targets, Bcl2 or Bcl2l1. Thus, RET activation improves HSC survival and in vivo transplantation efficiency, unveiling exciting new possibilities in transplantation and HSC ex vivo expansion. In addition, our work demonstrates that HSC use neurotrophic factors to regulate and maintain their fitness. RET signalling molecules are also expressed in thymocytes, more specifically, we found their expression in CD4/CD8 double negative thymocytes (DN). Nevertheless, ablation of Ret or it co-receptors Gfra1 and Gfra2 had a minor impact in foetal thymopoiesis. In agreement, Ret conditional knockout mice had similar thymocyte development and fitness when compared to their WT counterparts. Thus, while RET signalling is critical to HSC function, it is dispensable for T cell development in vivo. Altogether, our work show that molecular mechanisms usually assigned to specific tissues, can be more widely used by unrelated cell types, such as haematopoietic stem cells. Our findings also illustrate how a same signalling pathway can be regulated to originate different cell responses. Unlike several neuronal populations that use GFLs depending on the specific expressed co-receptor, HSCs express multiple RET coreceptors and respond to GFLs in a redundant fashion. There is increasing evidence that nervous signals can control haematopoiesis, namely by regulating osteoblast and mesenchymal stem cell function in HSC niches. Herein, we show that neurons and HSC employ common regulatory mechanisms. Thus, our work paves the way to further studies employing neurotrophic factors in HSC expansion and transplantation protocols.; O sistema hematopoiético, que inclui as células do sistema imunitário, é altamente complexo e dinâmico, e como tal, está sujeito a uma regulação apertada. Assim, o estudo dos mecanismos moleculares responsáveis pelo desenvolvimento de células hematopoiéticas é essencial para compreender a forma como este sistema funciona de modo a manter o equilíbrio entre o número de células necessárias em homeostasia e uma rápida resposta em situações de desequilíbrio. A tirosina cinase RET é o receptor para os factores neurotróficos da família do GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) (GDNF family ligands – GFLs) e tem uma função crucial no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso, no desenvolvimento embrionário do rim e na espermatogénese. Curiosamente, a expressão de Ret já foi detectada em várias populações de células hematopoiéticas e em órgãos linfoides primários como o fígado fetal, a medula óssea e o timo. Para além disso, foi também demonstrado um papel crucial da sinalização por RET em células hematopoiéticas envolvidas na organogénese das placas de Peyer no intestino durante a vida embrionária. No entanto, apesar de a expressão de RET ter sido identificada em várias populações celulares, uma possível função de RET no desenvolvimento ou função de células hematopoiéticas não é ainda conhecida. As células estaminais hematopoiéticas, pelas suas capacidades de autorrenovação e proliferação, são a base do programa de desenvolvimento e diferenciação que origina todas as células do sangue. Por este motivo, é crucial compreender os complexos mecanismos que regulam as células estaminais hematopoiéticas. Assim, no laboratório estamos particularmente interessados no papel de RET na função das células estaminais hematopoiéticas e no modo como a sinalização por RET pode ser usada de forma a modular a sua resposta em situações de desequilíbrio como a transplantação. Uma vez que foi proposto um efeito do ligando de RET GDNF na sobrevivência de timócitos in vitro, estamos também interessados em compreender a função de RET no desenvolvimento de células T in vivo. O timo é responsável pela produção de todas as populações de células T, que são essenciais para respostas imunitárias eficientes. Como tal é indispensável perceber de que modo o microambiente tímico fornece uma complexa rede de sinais que levam ao desenvolvimento de células T a partir de precursores da medula óssea. No laboratório descobrimos que a tirosina cinase RET tem uma função crítica na sobrevivência e função das células estaminais hematopoiéticas. Estas expressam a maquinaria de sinalização por RET, que inclui o receptor RET e os seus co-receptores, enquanto o microambiente onde as células estaminais hematopoéticas se encontram providencia os ligandos de RET necessários. Para além disso, a ablação de Ret leva à redução do número de células estaminais hematopoiéticas e ao recrutamento de células quiescentes para o estado proliferativo. Apesar de os progenitores hematopoiéticos deficientes em RET terem um potencial de diferenciação normal, apresentam uma fraca resposta ao stresse in vivo e um potencial de reconstituição reduzido. Importante, a sinalização de RET fornece factores de sobrevivência às células estaminais hematopoiéticas, por a jusante resultar na fosforilação da cinase p38/MAPK e na activação do factor de transcrição CREB. Em concordância, a sobreexpressão dos genes alvo a jusante de RET, Bcl2 ou Bcl2l1, resgata in vivo a função hematopoiética de progenitores deficientes em Ret, aumentado o seu potencial te transplantação. Na verdade, a activação de RET aumenta a sobrevivência de células estaminais hematopoiéticas e a sua eficiência de transplantação in vivo, revelando novas possibilidades de intervenção em terapias de transplantação e expansão ex vivo de células estaminais hematopoiéticas. Assim, o nosso trabalho mostra que factores neurotróficos presentes no nicho das células estaminais hematopoiéticas regulam a sua função através do receptor RET. Embora tenhamos confirmado que as moléculas envolvidas na sinalização de RET são expressas no timo, especialmente na população de timócitos negativa para os coreceptores CD4 e CD8 (DN), a remoção de Ret ou dos seus co-receptores Gfra1 ou Gfra2 não afecta a timopoiese fetal. Concordantemente, animais adultos com eliminação condicional de Ret em timócitos revelam que a capacidade de desenvolvimento de timócitos deficientes em Ret é semelhante à dos controlos selvagens. Do mesmo modo mutações que conferem um ganho de função no receptor RET não influenciam o desenvolvimento tímico. Assim, apesar de a sinalização por RET poder fornecer sinais de sobrevivência a timócitos, esta é dispensável para o desenvolvimento de células T in vivo, mesmo em condições de competição entre progenitores deficientes ou competentes em Ret. No seu conjunto, o nosso trabalho demonstra que mecanismos moleculares geralmente atribuídos a tecidos específicos, podem ser mais amplamente utilizado por tipos de células não relacionadas, tais como células estaminais hematopoiéticas. Os nossos resultados também ilustram como uma mesma via de sinalização pode ser 3 regulada de forma a originar diferentes respostas celulares. Contrariamente a diversas populações de neurónios, que usam GFLs específicos dependendo do coreceptor que expressam, as HSCs expressam múltiplos coreceptores de RET respondem aos GFLs de forma redundante. Existem cada vez mais evidências de que os sinais provenientes do sistema nervoso podem controlar hematopoiese, nomeadamente através da regulação da função dos osteoblastos e células estaminais mesenquimais presentes nos nichos das HSCs. Surpreendentemente, nós mostramos que os neurônios e as HSCs utilizam mecanismos comuns de regulação.. Deste modo, o nosso trabalho abre caminho a novos estudos na utilização factores neurotróficos em protocolos de expansão e transplantação de HSCs. Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Imunologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013

2013-01-01T00:00:00Z Domingues, Marco André Manso, 1985- http://hdl.handle.net/10451/8633 2013-06-19T14:41:49Z 2012-01-01T00:00:00Z

Title: Study of the mechanism of action of the antimicrobial peptide rBPI21 in gram-negative bacteria Authors: Domingues, Marco André Manso, 1985- Abstract: Antimicrobial peptides (AMPs) are currently looked as new candidates to overcome the bacterial resistance against therapeutic antibiotics. However, their mechanism of action remains unclear, despite several theories having been proposed. The understanding of the processes that govern AMPs activity is the best way to provide rational design of new antibiotics for further clinical use against bacterial infections. Human AMPs are part of the innate immune system and synthetic versions of these AMPs are good candidates, due to their low toxicity and high antimicrobial activity. It is believed that the mode of action of these AMPs involves their action at the membrane level. This thesis is focused on the study of the interaction of a fragment based on the N-terminal region of a human antimicrobial protein, the bactericidal/permeability increasing protein (BPI), with biomembrane model systems and bacterial cells. The fragment, named rBPI21, has antimicrobial properties and neutralizes the effect of the lipopolysaccharide (LPS) during bacterial infections. The thesis describes the use of biophysical strategies in order to unravel the fundamental steps involved in the bactericidal activity of rBPI21. Membrane selectivity was quantified using a range of biophysical techniques and reported in Chapters III and V. Chapter III reveals that rBPI21 prefers negatively charged liposome systems containing phosphatidylglycerol, which mimic bacterial membranes. The preference for the anionic phosphatidylglycerol membranes is followed by membrane aggregation/fusion and, at higher rBPI21 concentrations, there is a leakage of liposome content, as described in Chapter IV. Liposomes fusion leads to multilamellar membrane structures, as studied in Chapter V by small angle X-ray scattering. Previous studies revealed that rBPI21 was able to induce membrane perturbations on negatively charged membrane model systems mimicking the membranes of bacteria. On the other hand, membrane model systems that mimic eukaryotic membranes remain unaffected by the presence of rBPI21. In Chapter VI, the interaction of rBPI21 with bacteria was studied using atomic force microscopy, and the results were correlated with those obtained with membrane model systems in order to unravel the possible mechanism of action of the peptide. rBPI21 was shown to induce membrane perturbations, culminating in bacterial cells content leakage, both on the Gram-negative bacteria Escherichia coli and on the Gram-positive Staphylococcus aureus. The interaction of rBPI21 with bacteria was decreased in the presence of free lipopolysaccharide aggregates, demonstrating the affinity of rBPI21 for free LPS, as studied by force spectroscopy. The overall observed results potentiate the use of the rBPI21 in clinics against bacterial infections. Also, the development of new synthetic peptides based on rBPI21 structure is a valuable route to develop new therapeutic agents with antibacterial properties.; O aumento considerável das resistências bacterianas aos antibióticos em uso na prática clínica têm vindo a deixar as comunidades científica e clínica, alarmadas. O desenvolvimento de novas classes de antibióticos é urgente, para que se possa combater a resistência bacteriana adquirida. Os péptidos antibacterianos são vistos como novos candidatos para uso terapêutico nesta área. No entanto, ainda existem dúvidas e necessidades de esclarecimento quanto ao seu mecanismo de acção. A aquisição deste conhecimento, ainda em falta, irá permitir o desenvolvimento de novos péptidos para uso clínico contra infeções bacterianas e a optimização das suas aplicações e modo de administração. Os péptidos antibacterianos podem-se encontrar em quase todos os organismos vivos expostos à ação dos micróbios, desde os humanos até plantas e insetos. Estes agentes fazem parte da resposta rápida e eficaz contra patogénios. No caso dos humanos, o sistema imune inato é rico em péptidos antibacterianos, o que faz destes agentes bons candidatos para terapêutica, devido à baixa toxicidade e elevada actividade antibacteriana. A maioria dos péptidos antibacterianos são caracterizados principalmente por, em condições fisiológicas, possuírem carga global positiva devido à presença na sua constituição de grande quantidade de aminoácidos catiónicos, como é o caso de argininas e lisinas. É também conhecida a tendência para estas moléculas adquirirem uma estrutura anfipática, ou seja, são moléculas que apresentam uma região hidrófila e uma outra hidrófoba. Em concordância com estas características, estudos demonstram que a actividade antibacteriana destes péptidos ocorre maioritariamente ao nível da membrana. A selectividade destes agentes para as bactérias em detrimento das células humanas, por exemplo, deve-se sobretudo à presença de algumas moléculas específicas na superfície das bactérias, como é o caso dos lipopolissacáridos, e também de uma elevada percentagem de fosfolípidos aniónicos na membrana. É a carga negativa da membrana que potencia a atracão electrostática entre os péptidos antibacterianos e as membranas das bactérias. ação antibacteriana destes agentes ao nível das membranas das bactérias faz com que seja difícil para as bactérias adquirirem resistência. Isto implicaria alterações significativas na constituição membranar, o que levaria a uma alteração no potencial de membrana com custos energéticos e funcionais para a bactéria. De forma a desenvolver os péptidos antibacterianos como fármacos é necessário o estudo pormenorizado da ação dos mesmos em membranas. No entanto, as membranas biológicas são sistemas muito complexos para poderem ser usados na análise da actividade dos péptidos antibacterianos. Uma alternativa comummente usada e bastante viável prende-se com o uso de sistema modelo de membranas, nomeadamente o uso de vesículas lipídicas. É possível usar diferentes misturas de lípidos na realização destas vesículas permitindo aproximar da composição biológica das membranas das bactérias e humanas. Estes sistemas modelo de membranas podem ser usados com diferentes tamanhos, tendo sido nesta tese estudadas as interacções com vesículas lipídicas unilamelares grandes, de aproximadamente 100 nm, e também vesículas multilamelares com tamanhos compreendidos entre 1 e 100 micrometros. A ação sistémica dos antibióticos aquando da morte bacteriana é acompanhada pela libertação de certos componentes bacterianos em circulação sanguínea. Uns destes componentes são os lipopolissacáridos, que são libertados das membranas das bactérias Gram-negativas. Estas moléculas em circulação tornam-se agentes infecciosos que em baixas concentrações mantém o organismo em alerta contra patogénios, mas em concentrações elevadas originam uma produção excessiva de citocinas que podem culminar no choque séptico e daí resultando a morte. No caso de péptidos com actividade antibacteriana contra bactérias Gramnegativas é muito importante que, além da acção antibacteriana, os péptidos sejam capazes de neutralizar o efeito endotóxico do lipopolissacárido. A bactericidal/permeability increasing protein (BPI) é uma proteína homóloga da lipopolysaccharide binding protein (LBP) e que se encontra nos grânulos azurófilos dos neutrófilos. Além da sua actividade antibacteriana descrita é também conhecido o seu efeito neutralizador da ação do lipopolissacárido livre em circulação. Estas actividades estavam associadas à região amina da proteína. Desta forma foi desenvolvido um fragmento baseado nesta região, denominado rBPI21. O rBPI21 possui uma massa molecular de 21 kDa tendo actividade antibacteriana e também é capaz de se ligar ao lipopolissacárido, neutralizando a toxicidade provocada pelo mesmo. Esta tese de doutoramento está focada na interacção do rBPI21 com sistemas modelo de membranas e bactérias. Os estudos realizados ao longo deste trabalho foram essencialmente biofísicos, utilizando técnicas, como exemplo, espectroscopias dispersão de luz, de fluorescência e de força atómica. Nos Capítulos III e V desta tese de doutoramento é determinada, através da espectroscopia de fluorescência e da calorimetria de titulação isotérmica, a selectividade do rBPI21 para sistemas modelo de membranas com carga negativa conferida pelo fosfolípido fosfatidilglicerol. Estas membranas carregadas negativamente são um modelo aproximado das membranas das bactérias Gramnegativas. A preferência do rBPI21 para membranas contendo fosfatidiglicerol é seguida da formação de agregados membranares, estudada por espectroscopia de dispersão de luz, e também da fusão membranar. No entanto, a elevadas concentrações do rBPI21 ocorre a lise do sistema modelo de membrana. Estes estudos estão descritos no Capítulo IV da tese. No Capítulo V da tese mostra-se através do uso da dispersão de raios-X de pequeno ângulo que a interacção do rBPI21 com sistemas modelo de membranas é seguida da formação de sistemas multilamelares aquando da fusão membranar. Após os estudos efectuados com sistemas modelo de membranas, no Capítulo VI foi descrita a interacção do rBPI21 com bactérias, de forma a corroborar o mecanismo de acção observado nos sistemas modelo. Os estudos foram feitos com a bactéria Gram-negativa Escherichia coli e com a Gram-positiva Staphylococcus aureus. Estudos por microscopia de força atómica e espectroscopia de força mostram que o rBPI21 é capaz de causar a lise de ambas as bactérias e que a interacção do péptido com as mesmas é reduzida na presença de agregados livres de lipopolissacárido, evidenciando a afinidade do péptido para o lipopolissacárido na forma livre. Os resultados revelam para os determinantes da selectividade do rBPI21 para as membranas das bactérias, em detrimento das membranas de células humanas. Desta forma, o rBPI21 é um bom candidato para uso clínico, assim como um bom modelo para, através da sua estrutura, serem desenhados novos péptidos com maior actividade antibacteriana e reduzida toxicidade. Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012

2012-01-01T00:00:00Z Pombo, Samuel Filipe Gomes, 1979- http://hdl.handle.net/10451/8632 2013-06-18T14:11:12Z 2013-01-01T00:00:00Z

Title: As tipologias do alcoolismo:"da psicologia à neurobiologia dos fenótipos" Authors: Pombo, Samuel Filipe Gomes, 1979- Abstract: Perante a heterogeneidade imputada ao fenótipo clínico da dependência do álcool, tem-se assistido a varias tentativas de subtipificação de doentes alcoólicos em grupos mais homogéneos, no sentido de melhorar o conhecimento científico e adequar o doente a um protocolo terapêutico de maior efectividade. O estudo tem como objectivo a avaliação do processo de validação de cinco tipologias do alcoolismo, através de parâmetros psicológicos, clínicos e genéticos. Serão alvo de observação os modelos de Cloninger, Babor, Jellinek, Cardoso e Lesch. Foram recrutados da Consulta de Etilo-Risco do Serviço de Psiquiatria e Saúde Mental do Hospital de Santa Maria (HSM), 247 doentes dependentes do álcool (127 para o estudo dos polimorfismos genéticos). Os resultados demonstram que os subgrupos de dependentes do álcool se diferenciam em termos de características sócio-demográficas (idade, sexo), clínicas (precocidade e gravidade do problema, consumo de outras drogas) e psicológicas (psicopatologia e personalidade). A avaliação prospectiva (3 meses), verificou, no geral, uma pior evolução clínica (adesão e recaída) nos subtipos delta de Jellinek, sociopático e adictopático de Cardoso, tipo II de Cloninger e tipo IV de Lesch. Quanto a análise dos polimorfismos genéticos, destaca-se a associação entre o alelo L do polimorfismo da COMT e do alelo S do polimorfismo 5-HTT_LPR com o subtipo II de Cloninger. Conclui-se que a heterogeneidade da dependência do álcool não se expressa fenotipicamente de modo aleatório, pois os resultados enunciam que a sua disposição sintomatológica, configura-se em entidades sindromáticas clinicamente intuitivas, designadas por subtipos. Este paradigma das tipologias do alcoolismo visa a otimização do processo de diagnóstico, fornecendo um nível de compreensão e raciocínio clínicos indispensáveis à accão terapêutica futura.; Given the heterogeneity attributed to the clinical phenotype of alcohol dependence, several attempts have been made to subtype alcoholic patients in more homogeneous groups, in order to improve the scientific knowledge and matched patients to a therapeutical protocol of greater effectiveness. The study aims to evaluate the process of validation of five alcoholism typologies, through psychological, clinical and genetic parameters. Will be target for observation the models of Cloninger, Babor, Jellinek, Cardoso and Lesch. A sample of 247 alcohol dependent patients was collected in the alcoholism unit (NETER) of the Psychiatric Service of Santa Maria Universitary Hospital (127 for the study of genetic polymorphisms). The results demonstrate that the subgroups of alcohol-dependent subjects differ in terms of socio-demographic characteristics (age, gender), clinical (age of onset and severity of the problem, use of other drugs) and psychological (personality and psychopathology). Prospective evaluation (3 months), found, in general, a worse clinical outcome (compliance and relapse) in delta subtypes of Jellinek, sociopathic and adictopatic of Cardoso, Cloninger type II and type IV of Lesch. As for the analysis of genetic polymorphisms, highlights the association between the L allele of the COMT polymorphism and the S allele polymorphism 5-HTT_LPR with subtype II Cloninger. It could be concluded that the heterogeneity of alcohol dependence is not expressed phenotypically in a random basis, since the results state that its symptomatology is organized in clinically intuitive entities, called subtypes. This paradigm of alcoholism typologies aims the optimization of the diagnostic procedure, providing a level of understanding and clinical reasoning essential for future therapeutic action. Description: Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Desenvolvimento Humano e Social), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013

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