http://hdl.handle.net/10451/87 Tue, 14 May 2013 17:46:21 GMT 2013-05-14T17:46:21Z http://hdl.handle.net/10451/8256 Title: The role of fibrinogen in the mechanism of microvascular inflammatory response Authors: Almeida, Vanda Lúcia de Carvalho Vitorino de, 1979- Abstract: Neutrophils are among the first leukocytes to migrate from the blood to sites of inflammation. Here, they are able to recognize and engulf inflammatory agents, such as infectious agents and activate various anti-microbial strategies to inactivate and destroy them. Importantly, an efficient neutrophil recruitment and function will be pivotal for the success of the inflammatory response in recovering the host’s health. In inflammatory conditions, neutrophil recruitment from the bloodstream through the vascular endothelium into interstitial tissues requires successive interactions of neutrophils with the endothelial cells throughout this multistep process. Among diverse cellular adhesion molecules involved is the β2-integrin Mac-1 (CD11b/CD18), that by binding the endothelial ICAM-1 is specifically required during firm adhesion and leukocyte crawling. Additionally, this integrin has been shown to bind fibrinogen with a strong affinity as well as to its clotting product fibrin, among other molecular targets. Fibrinogen is a soluble glycoprotein present in the plasma that is importantly required for coagulation and the major determinant of blood viscosity and flow. It has been also proposed as a relevant player in inflammation in view of its ability to modulate the neutrophil function by potentiating degranulation, phagocytosis and antibody-dependent cellular cytotoxicity and by providing survival cues that delay apoptosis of activated neutrophils. One possible explanation for these effects could be that by binding Mac-1 in a low-avidity state, fibrinogen could function as a primer for resting neutrophils and thus decrease the threshold for cell activation. Taken all this, our goal in the present work was to address whether circulating fibrinogen could also modulate neutrophil recruitment and thus understand its role in the mechanism of microvascular inflammatory response. In this respect, we hypothesized that upon binding Mac-1, plasma fibrinogen could potentiate neutrophil-endothelial cell interaction by priming the neutrophil to a more adhesive phenotype. To test this, we first investigated whether soluble fibrinogen could modulate neutrophil activation, more precisely concerning the production of oxygen free radicals (OFR). By combining flow cytometry with dihydrorhodamine 123, we showed that by itself, soluble fibrinogen could induce OFR production by neutrophils isolated from human peripheral blood, arguing it could modulate neutrophil activation. Furthermore, we demonstrated this effect not to be Mac-1 dependent as: (i) fibrinogen did not interfere with the neutrophil Mac-1 activation and (2) an anti-total Mac-1 antibody known to block this integrin function did not impair the induced OFR production. Finally, binding of fibrinogen to the neutrophil’s membrane was observed independently of its co-localization with Mac-1 staining, arguing for the fibrinogen interaction with another unidentified neutrophil membrane receptor. Next, we addressed in vitro whether fibrinogen could modulate the adhesive behaviour of circulating neutrophils. For such, we used flow chamber assays that allowed the visualization and study of cell adhesion processes under well-defined wall shear stress. Human neutrophils were flown over monolayers of HUVECs at a constant wall shear stress of 0,1 dynes/cm2 in the presence or absence of soluble fibrinogen. Neutrophil’s adhesive behaviour was evaluated by determining the numbers of rolling and adherent neutrophils and the velocity of rolling. Under a physiological concentration (300mg/dL) of fibrinogen, the number of rolling neutrophils was not significantly affected in comparison to that measured in its absence. Surprisingly, the rolling velocities measured for the first were significantly higher than those exhibited by the latter. Additionally, the number of adherent fibrinogen-treated neutrophils was smaller than that determined for non-treated ones. This showed that at physiological concentrations, soluble fibrinogen could modulate the adhesive behaviour of circulating neutrophils towards activated endothelium. This effect may be important in a non-inflammatory condition by preventing excessive adhesion of neutrophils to the vascular wall and enabling adherent cells to easily detach from it. It may constitute an important mechanism to prevent unwanted accumulation of neutrophils in the vasculature and to avoid thrombus formation and growth. These results led us to propose that fibrinogen could further influence leukocyte recruitment in vivo and particularly, impact on the normal progression of acute inflammation. To explore this, the effect of soluble fibrinogen on leukocyte recruitment in acute inflammation was next evaluated in vivo by intravital microscopy of post-capillary venules of mouse mesentery. This approach allowed us to address specifically its contribution for leukocyte rolling and adhesion by determining the number of rolling leukocytes, their rolling velocities and the number of adherent leukocytes. To enable the in vivo study of leukocyte recruitment in the absence of soluble fibrinogen in the bloodstream, we made use of a mouse model bearing a disrupted fibrinogen α chain gene for which, homozygous individuals had been shown not to express any experimentally detected plasmatic soluble fibrinogen. As control groups, wild-type and heterozygous mice, known to possess normal coagulation patterns, were used. Acute inflammation was mimicked by superfusing the mesentery with PAF, a well-known neutrophil activator. Under these conditions, a slightly reduced number of rolling leukocytes was observed in homozygous (α-/-) mice when compared to both control groups. Despite this, rolling leukocytes migrated with increased velocities in homozygous (α-/-) mice when compared to those from control animals. Consistently, homozygous mice further displayed a diminished number of adherent leukocytes than the other groups. Overall, these observations led us to conclude that leukocyte recruitment is compromised in the absence of soluble fibrinogen in the blood circulation. Altogether our studies led us to conclude that soluble fibrinogen can modulate neutrophil activation and importantly, that it should constitute an important factor for leukocyte recruitment in acute inflammation. As soluble fibrinogen is able to bind either to the neutrophil or to the endothelial cell, one could envisage that it could also be able to bridge these two cellular identities and possibly favour a more stable and effective leukocyte recruitment. These results have profound implications in inflammation. As central players in the process, leukocytes need rapidly to cross the vascular wall and reach the inflamed areas. If this is affected due to absent or reduced levels of plasmatic soluble fibrinogen, ineffective immune responses will be elicited to invading pathogens. This will compromise the organism’s health by enhancing the risk of sepsis development among other possible pathological consequences.; Os neutrófilos estão entre os primeiros leucócitos a migrar da corrente sanguínea para o local da inflamação. Um vez no local, estes possuem a capacidade de reconhecer e englobar os agentes causadores de infecções desenvolvendo estratégias anti-microbianas de forma a conseguir desativar e destruir esses mesmos agentes. Assim sendo, é importante salientar que um recrutamento de neutrófilos funcional e eficiente é fundamental para o sucesso da resposta inflamatória e para recuperação da saúde do hospedeiro. Em situações inflamatórias, o recrutamento dos neutrófilos é feito a partir do sangue e através do endotélio vascular para os tecidos intersticiais, este recrutamento consiste num processo com várias etapas que requer interações sucessivas do neutrófilos com as células endoteliais. Entre as várias moléculas de adesão celular envolvidas neste processo, é a integrina-β2, Mac-1 (CD11b/CD18), que permite que neutrófilos se liguem á ICAM-1 endotelial, passo essencial para a adesão firme dos leucócitos e o seu consequente alongamento. Além disso, foi também demonstrado que o fibrinogénio, assim como a fibrina, são ligandos de alta afinidade para esta mesma integrina, para além de outros alvos moleculares. O fibrinogénio é uma glicoproteina solúvel que está presente no plasma, sendo um dos elementos determinantes para o fluxo e viscosidade sanguínea, desempenhando ainda uma função fundamental na coagulação. Para além desta funções sobejamente conhecidas foi proposto por vários autores que fibrinogénio tem também uma função relevante no processo inflamatório tendo em conta a sua capacidade em modular a função do neutrófilo potenciando a sua desgranulação, fagocitose e atrasando a apoptose dos neutrófilos ativados. Uma das possíveis explicações para estes efeitos está diretamente relacionada com a ligação do fibrinogénio á Mac-1 quando esta se encontra em baixa afinidade, o fibrinogénio pode não só pre-ativar os neutrófilos mas também facilitar a sua ativação. Tendo tudo isto em consideração, o objetivo deste trabalho consiste investigar se o fibrinogénio solúvel que se encontra em circulação pode ou não modular o recrutamento dos neutrófilos e desta forma modular a resposta inflamatória microvascular. Na primeira abordagem a esta pergunta começou-se por investigar se o fibrinogénio solúvel ao ligar-se á Mac-1, poderia facilitar a interação entre as células endoteliais e os neutrófilos facilitando a sua adesão. Começou-se por tentar perceber se o fibrinogénio solúvel pode modular a ativação dos neutrófilos, tendo como medida de ativação a produção de radicais livres de oxigénio (OFR). Recorrendo á citometria de fluxo e á incubação dos neutrófilos com diidrorodamina 123, conseguiu-se provar que o fibrinogénio só por si induz a produção de OFR pelos neutrófilos isolados a partir de sangue periférico humano, ativando-os. Para além disso, demonstrou-se ainda que este efeito não é dependente da ligação do fibrinogénio á Mac-1, uma vez que, mesmo quando foi utilizado um anticorpo bloqueador da Mac-1 a produção de OFR não foi afectada. Para além disso, foi também verificado por microscopia confocal que não existe uma colocalização entre a marcação por Mac-1 e pelo fibrinogénio, o que sugere um receptor ainda não identificado para o fibrinogénio, na membrana do neutrófilo. Seguidamente, utilizando uma abordagem in vitro, investigou-se se o fibrinogénio conseguia modular o efeito adesivo dos neutrófilos em circulação. Para tal recorreu-se ao uso de uma camara de fluxo laminar que permitiu a visualização do processo de adesão com “shear-stress constante. Os neutrófilos isolados a partir de sangue periférico humano foram colocados sobre uma monocamada de HUVECs com um fluxo constante de 0,1 dynes/cm2 na presença e na ausência de fibrinogénio solúvel. O comportamento adesivo dos neutrófilos foi avaliado contando o numero de neutrófilos em rolamento e aderidos e determinando a sua velocidade de rolamento. A uma concentração fisiológica (300mg/dL) de fibrinogénio, o numero de neutrófilos em rolamento não foi afectado significativamente quando comparado com o numero encontrado na ausência de fibrinogénio. Mas surpreendentemente as velocidades de rolamento foram significativamente superiores na presença do fibrinogénio. Determinou-se ainda que o numero de neutrófilos aderidos na presença de fibrinogénio foi mais pequeno do que na sua ausência. O que conduziu á conclusão que o solúvel fibrinogénio em concentrações fisiológicas podem influenciar a adesão dos neutrófilos circulantes à parede endotelial ativada. Este efeito assume especial importância em situações não-inflamatórias, prevenindo a adesão excessiva de neutrófilos á parede vascular e também facilitando que células aderentes facilmente se libertem. Pode assim constituir um mecanismo importante para prevenir a acumulação não desejada de neutrófilos na vasculatura e impedir a formação e crescimento de trombos vasculares. Estes resultados conduziram a que se propusesse que o fibrinogénio pode influenciar o recrutamento dos leucócitos in vivo, e particularmente, ter um importante impacto na normal progressão de uma inflamação aguda. De forma a explorar esta hipótese, o efeito do fibrinogénio solúvel no recrutamento dos leucócitos durante uma inflamação aguda, foi utilizada uma abordagem in vivo, recorrendo á microscopia intravital das vénulas pós-capilares do mesentério do murganho. Esta abordagem permitiu visualizar diretamente e contar o numero de leucócitos aderidos e em rolamento assim como determinar as sua velocidades de rolamento. O modelo animal utilizado nesta abordagem foi um murganho geneticamente alterado, sem a cadeia α do fibrinogénio o que faz com que os indivíduos homozigoticos não possuam fibrinogénio em circulação. Como grupo controlo foram utilizados murganhos “wild-type” e heterozigoticos que possuem um padrão de coagulação normal. De forma a recriar uma situação de inflamação aguda, perfundiu-se o mesentério com PAF, um ativador de neutrófilos bem descrito na literatura. Nesta condições, foi encontrado um numero ligeiramente reduzido de leucócitos em rolamento nos murganhos homozigoticos(α-/-) quando comparado com o numero encontrado tanto nos murganhos heterozigoticos como nos “wild-type”. No entanto, a velocidade de rolamento é superior nos murganhos homozigoticos(α-/-) quando comparada com os mesmos grupos controlo. Consistentemente com este resultado, também o numero de leucócitos aderentes foi inferior neste grupo quando comparado com o mesmo grupo controlo. Estes resultados permitiram concluir que o recrutamento leucocitário ficou comprometido na ausência do fibrinogénio solúvel em circulação. De uma forma global, este trabalho permitiu concluir que o fibrinogénio solúvel pode modular a ativação dos neutrófilos e ainda constituir um factor importante para o recrutamento leucocitário durante uma situação de inflamação aguda. O fibrinogénio solúvel tem a capacidade de se ligar não só ao neutrófilo mas também ás células endoteliais, podendo assim servir de ponte de ligação entre estas duas identidades celulares e desta forma favorecer um recrutamento leucocitário mais eficaz e mais estável. Estes resultados tem implicações importantes no processo inflamatório. Sendo os neutrófilos células determinantes neste processo, precisam de conseguir atravessar rapidamente a parede vascular e chegar ao local onde ocorre a inflamação. Se este processo se encontra comprometido devido a uma concentração reduzida ou mesmo á ausência de fibrinogénio solúvel em circulação, a resposta imunitária fica comprometida e suscetível á invasão por agentes patogénicos. O que compromete a saúde do organismo aumentando o risco de um possível choque séptico entre outras consequências patológicas. Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Funcionais), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013 Tue, 01 Jan 2013 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10451/8256 2013-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10451/8016 Title: Synovial doppler ultrasonography and dynamic magnetic resonance imaging of the hand and wrist in the assessment of early inflammatory arthritis versus rheumatoid arthritis:contribution for a new prediction model Authors: Navalho, Márcio César Lino Ribeiro Cordeiro, 1976- Abstract: The aim of this thesis was to identify the impact that newer imaging modalities namely Power Doppler ultrasound (P-DUS) and Dynamic Magnetic Resonance Imaging (D-MRI) have on the identification of individuals with early undifferentiated arthritis who eventually evolve to rheumatoid arthritis (RA). In the Part I of our thesis we used a D-MRI protocol directed to both wrists and hands that included a volumetric interpolated breath-hold (VIBE) sequence with nearly isotropic resolution. We found that relative enhancement (RE), rate of early enhancement (REE), and Rheumatoid Arthritis Magnetic Resonance Imaging Scoring System (RAMRIS) score for synovitis were significantly correlated with the disease activity score with 28 joint count (DAS28), suggesting that these parameters, even in early disease, can reflect the actual state of joint inflammation and disease activity. In the part II of our thesis tenosynovitis of the extensor carpi ulnaris and of the flexor tendons of the second finger, in addition to radiocarpal joint synovitis, were recognised as significantly associated with progression to RA in patients with arthritis for less than 3 month’s duration. Joint asymmetry rates of three quarters in very early RA (VERA) patients and two thirds in early RA (ERA) patients were detected, providing a morphological confirmation that early RA may be an asymmetrical disease and highlighting the relevance of a bilateral imaging protocol. In the part III of our study we compared P-DUS and MRI findings of synovial inflammation using a bilateral hand and wrist evaluation. We identified a significant higher prevalence of synovitis by MRI. We also demonstrated a significant better diagnostic performance of 3-T MRI in comparison to US for RA diagnosis. If we took into consideration the group of patients with US joint and tendon count ≤ 10, the American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism (ACR/EULAR) criteria diagnostic performance was significantly improved by correcting clinical joint counts with MRI joint and tendon counts. Our findings suggest that there is a specific subset of patients that can benefit from MRI joint and tendon counts. Our results allow us to state that bilateral US and MRI evaluation of the hands and wrists in early arthritis can contribute for the early identification of RA patients. Identifying individuals at high risk of developing RA as soon and as precisely as possible is known as critical for the initiation of appropriate anti-rheumatic therapy.; O objectivo desta tese foi identificar o impacto que novas técnicas de imagiologia, como a Ecografia Doppler (ECO-D) e a Ressonância Magnética Dinâmica (RM-D) podem ter na identificação de indivíduos que desenvolvem artrite reumatóide (AR), entre os que se apresentam com artrite indiferenciada precoce. Na parte I desta tese utilizámos um protocolo de RM-D que incluiu uma sequência volumétrica interpolada (VIBE), com resolução quase isotrópica. Identificámos que a captação tardia, o índice de captação tardia e o score RAMRIS para sinovite encontram-se significativamente correlacionados com o score DAS28, sugerindo que estes parâmetros, mesmo em fase precoce da doença, podem refletir o grau atual de inflamação e de atividade da doença. Na parte II desta tese a tenossinovite do extensor ulnar do carpo, dos tendões flexores do segundo dedo e da articulação radio-cárpica, foram reconhecidos como estando significativamente associados à progressão para AR em doentes com artrite de menos de 3 meses de duração. No nosso estudo bilateral foi detectada uma prevalência de assimetria de 80% nos doentes muito precoces e de 69.3% nos doentes precoces, fornecendo uma confirmação morfológica de que a AR pode ser uma doença assimétrica na fase inicial e salientando a importância de um protocolo de aquisição bilateral. Na parte III do nosso estudo comparámos os achados de inflamação sinovial em ECO-D e RM utilizando uma avaliação bilateral das mãos e punhos. Identificámos uma prevalência significativamente superior de sinovite por RM. Igualmente demonstrámos uma performance diagnóstica significativamente superior da RM em 3-T quando comparada com a Eco para o diagnóstico de AR. Se tomarmos em consideração o grupo de doentes com contagem articular e tendinosa em ecografia ≤ 10, verificamos que a performance dos critérios ACR/EULAR fica significativamente melhorada, se substituída a contagem clínica pela contagem em RM. Os nossos achados sugerem assim que existe um subgrupo específico de doentes que pode beneficiar da contagem articular e tendinosa por RM. Os nossos resultados permitem afirmar que a avaliação bilateral das mãos e punhos por Eco e RM na artrite inicial podem contribuir para a identificação precoce de doentes com AR. A identificação de indivíduos em risco de desenvolver AR tão precocemente quanto possível é reconhecidamente um factor crítico para início de terapêutica anti-reumática apropriada. Description: Tese de doutoramento, Medicina (Imagiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012 Sun, 01 Jan 2012 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10451/8016 2012-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10451/7855 Title: CK2 as a potencial novel therapeutic target in chronic lymphocytic leukemia Authors: Martins, Leila Raquel Galveias Casquinha Pires Abstract: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the Western world and is characterized by the accumulation of mature, monoclonal B cells in the blood, bone marrow and secondary lymphoid organs. Clinically, CLL is a very heterogeneous disease with overall survival raging from a few years to decades. Prognostic indicators include immunoglobulin heavy chain variable region (IGVH) mutation status, cytogenetic abnormalities, clinical stage, lymphocyte doubling time, peripheral blood leukocyte counts and β 2 microglobulin levels, and ZAP-70 and CD38 expression. Important advances have been made in identifying inherited and acquired genetic mutations, exploring the role of B cell receptor (BCR) signaling, and understanding the relation between CLL cells and the tumor microenvironment. These advances reveal CLL to be a disease that is reliant on the interplay between inherited, environmental, and host factors. New therapeutic approaches have had a dramatic impact on the outcome of patients with CLL improving overall survival. However, not all patients can tolerate aggressive regimens, high risk groups remain having poor response to treatment, and patients continue to relapse. This defines CLL as an incurable malignancy warranting the development of new therapeutic strategies. In this context, specific inhibition of signaling elements essential for leukemia cell survival offers great promise for the design of more efficient and selective therapies that can bypass resistance mechanisms. The ubiquitous serine/threonine protein kinase CK2, a tetramer consisting of 2 catalytic (α and/or α’) and 2 regulatory β subunits, is highly pleiotropic and intervenes laterally on many signaling pathways. More than 300 CK2 substrates have been identified so far but it is predictable that they can be much more, and that CK2 alone can contribute to the generation of the eukaryotic phosphoproteome more than any other individual protein kinase. CK2 can drive tumorigenesis by different mechanisms, playing a global anti-apoptotic role, enhancing multi-drug resistance, activating the chaperone machinery that protects the onco-kinome, and sustaining neo-vascularization. Overexpression of CK2 has been consistently observed in human cancers, including lung, kidney, head and neck, prostate and breast. Importantly, inhibition of CK2 activity, using specific pharmacological inhibitors or silencing the catalytic subunit, has been shown to decrease the survival of multiple myeloma, acute myeloid leukemia and T-cell acute lymphoblastic leukemia cells. In CLL, the genes that code for CK2α (CSNK2A1) and CK2β (CSNK2B) were identified as a part of a poor prognosis cluster associated with shorter treatment-free survival. Primary CLL cells display constitutive activation of PI3K kinase activity, which appears to be critical for CLL cell survival. PTEN, the main negative regulator of PI3K signaling pathway, can be phosphorylated by CK2 at the C terminus, leading to PTEN functional inactivation and concomitant increased protein stability. We previously showed that CK2 overexpression/hyperactivation in primary T-cell acute lymphoblastic leukemia cells induces PTEN non-deletional posttranslational inactivation by phosphorylation and consequent PI3K pathway hyperactivation. However, the relative expression and functional impact of CK2 in CLL remains to be established. In the first part of this study (Chapter 2), we demonstrate that CK2 plays a critical role in the maintenance of CLL cell viability. Primary CLL cells displayed significantly higher CK2 expression and activity than normal B cells. Furthermore, inhibition of CK2 activity induced apoptosis of leukemia cells without significantly affecting normal B and T lymphocytes. Importantly, this effect is not reversed by co-culture with stromal cells, which are otherwise capable of rescuing CLL cells from in vitro spontaneous apoptosis. CLL cell death upon CK2 inhibition was mediated by inactivation of PKC, a PI3K downstream target, and correlated with increased PTEN activity, indicating that CK2 promotes CLL cell survival at least in part via PI3K-dependent signaling. Although CK2 antagonists induced significant apoptosis of CLL cells in all patient samples analyzed, sensitivity to CK2 blockade positively correlated with the percentage of CLL cells in the peripheral blood, β2 microglobulin serum levels and clinical stage. These data suggest that subsets of patients with aggressive and advanced stage disease may especially benefit from therapeutic strategies targeting CK2 function. Overall, our results identify CK2 as a critical regulator of CLL cell viability and originated two publications in peerreviewed international journals (Martins et al, Blood 2010; Martins et al, Mol Cell Biochem 2011). Given these promising results, we sought to validate CK2 as a therapeutic target for intervention in CLL by testing, in vitro and in mouse models, CK2 inhibitors that are currently in phase I clinical trials for other cancers (Chapter 3). Several inhibitors have been used to modulate CK2 activity in vitro but only two have entered clinical trials, CX4945 (Cylene Pharmaceuticals, USA) and CIGB300 (Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Cuba). CX4945 is an orally available ATP-competitive inhibitor of CK2 with a potent and highly specific inhibition of CK2 enzymatic activity. It decreases the viability and proliferation of a broad spectrum of cancer cell lines, and shows antitumor efficacy in subcutaneous xenograft mouse models. In phase I clinical trials, CX4945 induced stable disease in 20% of patients with a variable spectrum of solid tumors. Importantly, adverse effects reported were generally of mild to moderate intensities. CIGB300 is a cyclic peptide which inhibits CK2 phosphorylation by binding to the acidic phosphoacceptor site on CK2 substrates. CIGB300 demonstrated an antiproliferative and pro-apoptotic effect in a variety of tumor cell lines, and elicited significant antitumor effect both in subcutaneous murine syngenic tumors and subcutaneous xenograft mouse models. Notably, phase I clinical trials in cervical cancer showed a significant decrease of the tumor, and the peptide was found to be safe and well tolerated in the dose range studied. In our study, both CX4945 and CIGB300 induced a significant decrease in the viability and proliferation of CLL cell lines with clinically suitable IC50 values. One of these cell lines, MO1043, was further injected subcutaneously in Nude mice and both inhibitors were able to significantly delay tumor development. Importantly, in vivo combination of CX4945 with fludarabine, a commonly used drug in CLL, significantly improved treatment outcome when compared with fludarabine alone, suggesting a potential therapeutic synergism between CX4945 and fludarabine. This could enable a decrease in the administration of fludarabine to patients, and consequently in its adverse effects. In addition, it could also increase the sensitivity of CLL cells to fludarabine – a finding of particular importance for drug-refractory patients. Moreover, both inhibitors showed to promote apoptosis in all primary CLL samples analyzed, in a dose and time-dependent manner, independently of the presence of genetic abnormalities such as 11q deletion. Consistent with our previous findings, clinically-relevant CK2 inhibitors had a greater effect on cells from patients with advance disease and/or high tumor burden. Finally, CK2 inhibition increased PTEN activation and down-modulated the activity of Akt and PKC, two major downstream targets of PI3K oncogenic pathway. Overall, our data indicates that CK2 may be a valuable therapeutic target in CLL and further provide rationale for the initiation of human clinical trials.; A leucemia linfóide crónica (LLC) é a leucemia mais comum nos países ocidentais e é caracterizada pela acumulação de linfócitos B maduros no sangue, medula óssea e orgãos linfóides secundários. Clinicamente a LLC é uma doença muito heterogénea, com um tempo de sobrevida que pode variar de anos a décadas. Os factores de prognóstico utilizados incluem estado mutacional da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina, anomalias citogenéticas, expressão de ZAP-70 e CD38, estadio clínico, tempo de duplicação linfocitário, número de leucócitos no sangue periférico e concentração sérica de β2 microglobulina. A investigação em LLC tem dado passos importantes, nomeadamente ao nível da identificação de alterações genéticas inatas ou adquiridas, no estudo da sinalização através do receptor de linfócitos B, e na compreensão da relação dos linfócitos B com o micro-ambiente tumoral. Estes avanços revelaram que a LLC é uma doença complexa que depende da interacção entre factores inatos, adquiridos e ambientais. Por seu turno, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas em LLC tem tido resultados favoráveis com um aumento no tempo médio de sobrevida dos doentes. No entanto, nem todos os doentes toleram regimes de tratamento agressivos, grupos de alto risco continuam com uma fraca resposta à terapêutica, e a maioria dos doentes acaba por recidivar. Estes factos definem a LLC como uma doença incurável que reclama a identificação de novas estratégias de tratamento. Neste contexto, a inibição de elementos de sinalização intracelular essenciais à sobrevivência das células leucémicas oferece grande potencial no desenvolvimento de tratamentos mais eficientes, específicos e que ultrapassem mecanismos de resistência à quimioterapia. A cinase de serina/treonina CK2, constituída por 2 subunidades catalíticas (α e/ou α’) e 2 subunidades reguladoras (β), é ubíqua e altamente pleiotrópica, intervindo lateralmente em inúmeras vias de transdução de sinal. Até à data foram identificados mais de 300 substratos de CK2, sendo previsível que existam muitos mais e que CK2 possa contribuir para o fosfoproteoma eucariota mais do que qualquer cinase. CK2 pode participar no processo de tumorogénese através de diferentes mecanismos, nomeadamente, pela sua função anti-apoptótica, aumentando a resistência a quimioterápicos, activando chaperonas que protegem o onco-quinoma e/ou estimulando a neo-vascularização. A sobre-expressão de CK2 tem sido consistentemente observada em células tumorais de diversos orgãos, tais como o pulmão, rim, cabeça e pescoço, próstata e mama. Mais importante ainda é a diminuição de viabilidade verificada com a inibição de CK2 em células de mieloma múltiplo, leucemia mielóide aguda e leucemia linfoblástica aguda, através de inibidores farmacológicos ou do silenciamento da subunidade catalítica. Em LLC, os genes que codificam para CK2α (CSNK2A1) e CK2β (CSNK2B) foram identificados como parte de um grupo associado a mau prognóstico, com menos tempo até à necessidade de tratamento. Células primárias de LLC demonstram activação constitutiva da cinase PI3K, que parece ser essencial para a sobrevivência destas. PTEN, o principal regulator negativo da via de sinalização PI3K, pode ser fosforilado por CK2, fenómeno que leva à inactivação funcional de PTEN e ao aumento da estabilidade da proteína. Em estudos anteriores, demonstrámos que a sobre-expressão e sobre-activação de CK2 em células de leucemia linfoblástica aguda de linfócitos T induz a inactivação póstraducional de PTEN e consequente hiperactivação da via PI3K. No entanto, a expressão de CK2 relativamente a linfócitos B normais, bem como o papel funcional de CK2 em LLC, ainda se encontra por definir. Na primeira parte deste estudo (Capítulo 2), demonstrámos que CK2 desempenha um papel fundamental na manutenção da viabilidade das células LLC. Células primárias de LLC apresentam um aumento significativo da expressão e actividade de CK2 quando comparadas com linfócitos B de dadores saudáveis. Além disso, a inibição da actividade de CK2 promove apoptose das células leucémicas sem afectar significativamente linfócitos T e B normais. É de referir que este efeito não é revertido pela co-cultura com células estromais, que têm a capacidade de proteger as células LLC da apoptose espontânea in vitro. Acresce que a morte das células LLC por inibição de CK2 é mediada pela inactivação de PKC, um efector da via PI3K, e tal facto apresenta uma correlação significativa com o aumento da actividade de PTEN, indicando que CK2 promove a viabilidade das células LLC dependente, pelo menos em parte, da via PI3K. Apesar de os inibidores de CK2 induzirem apoptose significativa em todas as amostras de doentes LLC analisadas, a sensibilidade à inibição de CK2 demonstrou uma correlação positiva com a percentagem de células LLC no sangue periférico, com os níveis séricos de β2 microglobulina e com o estadio clínico. Estes resultados sugerem que doentes com doença avançada ou particularmente agressiva poderão ser os principais beneficiários de estratégias de tratamento que visem a inibição da actividade de CK2. No geral, estes resultados indicam que CK2 desempenha um papel crítico na viabilidade das células LLC, tendo resultado na publicação de dois artigos em revistas internacionais com arbitragem (Martins et al, Blood 2010; Martins et al, Mol Cell Biochem 2011). Tendo em conta os resultados promissores descritos acima, decidimos validar CK2 como alvo terapêutico em LLC testando, in vitro e em modelos murinos, inibidores de CK2 que se encontram actualmente em ensaios clínicos (Capítulo 3). Actualmente existem vários inibidores de CK2 que podem ser usados para modular a actividade desta cinase in vitro, mas somente dois se encontram em ensaios clínicos: CX4945 (Cylene Pharmaceuticals, USA) e CIGB300 (Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Cuba). CX4945 é um inibidor de CK2 altamente específico e potente, que funciona por competição pela ligação ao sítio de ligação do ATP, e que foi especificamente formulado para administração oral. Este inibidor diminui a viabilidade e a proliferação de várias linhas celulares tumorais e possui eficácia anti-tumoral em modelos de ratinhos xenotransplantados subcutaneamente. Em ensaios clínicos de fase I, CX4945 induziu estabilização de vários tumores sólidos em 20% dos doentes. De salientar que os efeitos secundários registados foram de intensidade fraca a moderada. CIGB300 é um peptido cíclico que inibe a actividade de CK2 por ligação ao local de fosforilação no substrato. CIGB300 também possui um efeito pro-apoptótico e anti-proliferativo em várias linhas tumorais, e um efeito anti-tumoral significativo em modelos murinos singénicos e xenotransplantados subcutanemente com linhas tumorais humanas. Os ensaios clínicos de fase I em cancro do cérvix demonstraram uma diminuição significativa do tumor, e o inibidor foi bem tolerado nas doses usadas. No nosso estudo, CX4945 e CIGB300 induziram uma diminuição da viabilidade e proliferação de várias linhas celulares de LLC com valores de IC50 dentro do aceitável para eventual translação clínica. Seguidamente, uma das linhas celulares de LLC, MO1043, foi injectada subcutaneamente em ratinhos Nude e verificou-se que ambos os inibidores foram capazes de atrasar o desenvolvimento tumoral. Além disso, a combinação de CX4945 com fludarabina, um quimiterápico utilizado frequentemente no tratamento de LLC, demonstrou ser significativamente superior à utilização de fludarabina isoladamente. Estes resultados sugerem que existe um sinergismo entre estes dois fármacos, o que poderá vir a possibilitar a redução da dose de fludarabina, e consequentemente dos seus efeitos secundários. As nossas observações são de potencial relevância para doentes refractários ao tratamento com fludarabina. Relativamente a células LLC primárias, ambos os inibidores demonstraram induzir apoptose em todas as amostras analisadas, proporcionalmente à concentração e tempo de exposição ao fármaco, e independentemente da presença de anomalias genéticas, tais como deleção 11q. Em concordância com observações anteriores, a inibição de CK2 com agentes testados clinicamente teve maior efeito em células LLC de doentes com estadio mais avançado e/ou maior carga tumoral. Finalmente, a inibição de CK2 levou a um aumento da actividade de PTEN e a uma diminuição da actividade de Akt e PKC, dois elementos fundamentais da via de sinalização oncogénica PI3K. Em conclusão, os resultados deste estudo sugerem que CK2 poderá ser um alvo importante no tratamento de LLC, fornecendo dados que motivam a inclusão de doentes com esta doença em ensaios clínicos de inibição de CK2. Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012 Sun, 01 Jan 2012 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10451/7855 2012-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10451/7600 Title: A best evidence medical education (BEME) systematic review on the feasibility, reliability and validity of the objective structured clinical examination (OSCE) in undergraduate medical studies Authors: Patrício, Madalena Folque, 1948- Description: Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Educação e Comunicação em Ciências da Saúde), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012 Sun, 01 Jan 2012 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10451/7600 2012-01-01T00:00:00Z