Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/10078
Título: Mycobacteria manipulation of host proteases and inflammatory pathways during infection within human macrophages and dendritic cells
Autor: Marques, Joana Pereira, 1989-
Orientador: Anes, Elsa, 1964-
Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-
Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis
Macrófagos
Células dendríticas
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Macrophages and dendritic cells (DCs) play an essential role during mycobacterial infection, acting as key effector cells in bacterial killing and antigen presentation. Cathepsins are host proteases involved in pathogen destruction and antigen presentation. This makes these proteases, as well as both cell types, perfect targets for mycobacterial manipulation. In the first part of this thesis the role of mycobacteria during macrophage activation and DC maturation was addressed. By flow cytometry the surface expression of activation and maturation markers of mycobacteria infected human macrophages and DCs, was analyzed. It was demonstrated that: (1) M. tuberculosis H37Ra prevents the induction of the classical activated macrophage phenotype; (2) induces the maturation process of immature DCs; (3) the outcome of infection with M. tuberculosis H37Ra differs from that with M. smegmatis. These results indicate that M. tuberculosis infection has a differential role during macrophage activation and DC maturation and that M. tuberculosis H37Ra interferes with these processes differently of the non-pathogenic M. smegmatis. In the second part, we aimed to decipher the role of cathepsins during mycobateria infection of macrophages and DCs. Cathepsins protein levels were analyzed by western blot after infection with pathogenic or non-pathogenic mycobacteria. It was shown that cathepsin B and S levels during M. tuberculosis infection are distinct from those of host cells that internalized M. smegmatis and this is dependent on the host cell species tested. In addition, the role of these proteases in M. tuberculosis intracellular survival was evaluated by silencing cathepsins expression, using shRNA lentiviral vectors. It was observed, that cathepsin B and S knockdowns led to an increase in M. tuberculosis H37Ra intracellular survival. Altogether, these evidences point for a role of both cathepsins in the control of M. tuberculosis intracellular growth and demonstrate that M. tuberculosis modulates these cathepsins differently of the non-pathogenic M. smegmatis.
A tuberculose representa um dos mais graves problemas de saúde pública, causando anualmente cerca de dois milhões de mortes em todo o mundo. Estima-se que cerca de um terço da população mundial se encontra infectada com Mycobacterium tuberculosis, o microrganismo patogénico causador desta doença infecciosa. A emergência de estirpes de M. tuberculosis multirresistentes e extensivamente resistentes à terapêutica antibiótica utilizada, aliado ao facto de a única vacina disponível possuir baixa eficácia contra a tuberculose pulmonar, vem realçar a necessidade urgente de se encontrar novos alvos terapêuticos e novas estratégias para controlar a doença. O sucesso deste patogénio reside, principalmente, na sua capacidade de sobreviver e de se dividir no interior de células imunitárias. Após ser internalizado pelos macrófagos, M. tuberculosis inibe a fusão do fagossoma com o lisossoma, escapando assim à acção das enzimas proteolíticas (catepsinas) e ao ambiente acídico do fagolisossoma. Em paralelo, os macrófagos infectados induzem uma resposta pró-inflamatória, que promove o recrutamento de células imunitárias da corrente sanguínea para o local da infecção. Forma-se o granuloma, a estrutura característica da tuberculose, que se pensa ser capaz de conter a infecção micobacteriana. Aqui, algumas micobactérias podem permanecer num estado de latência durante um longo período de tempo. Apenas 5 a 10% da população infectada desenvolve a doença activa, o que na maioria dos casos se deve a uma imunodepressão do hospedeiro. Nos pulmões, M. tuberculosis é internalizado por macrófagos alveolares residentes, mas também por células dendríticas recrutadas da corrente sanguínea. Estes dois tipos de células apresentadoras de antigénios desempenham papéis distintos na imunidade contra a tuberculose. Os macrófagos ao induzirem os seus mecanismos bactericidas são os principais responsáveis pela destruição das micobactérias. Por outro lado, as células dendríticas são especializadas na apresentação de antigénios micobacterianos às células T naïve, que se encontram nos nódulos linfáticos. De modo a conseguirem desempenhar estas funções, é necessário que ocorra um processo de activação dos macrófagos assim como um processo de maturação das células dendríticas. Estudos anteriores mostram que as micobactérias têm a capacidade de interferir com estes processos. As catepsinas são proteases que estão envolvidas num grande número de processos celulares em macrófagos e células dendríticas, tais como: destruição dos patogénios, processamento e apresentação de antigénios, processamento de várias enzimas celulares do hospedeiro e também apoptose. O seu vasto número de funções, e em particular o seu papel na destruição dos patogénios e na apresentação de antigénios, faz destas proteases alvos perfeitos para manipulação por micobactérias durante a infecção de macrófagos e células dendríticas. Na primeira parte desta tese, é explorado o papel das micobactérias durante a activação dos macrófagos e a maturação das células dendríticas. Foram infectados macrófagos e células dendríticas, diferenciados a partir de monócitos isolados do sangue periférico de dadores humanos saudáveis, com micobactérias que expressavam a proteína verde fluorescente (GFP), nomeadamente a estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra GFP e a espécie não patogénica M. smegmatis. Através de citometria de fluxo, foram seleccionadas apenas as células infectadas com micobactérias fluorescentes e o efeito da infecção foi analisado pela medição da expressão de marcadores superficiais de activação e maturação. Ao infectar macrófagos não activados (M0) com M. tuberculosis H37Ra, verificou-se que a infecção impede a indução da clássica resposta pró-inflamatória M1, ao nível das moléculas apresentadoras de antigénios. Pelo contrário, a infecção de macrófagos M0 com M. smegmatis tem um efeito estimulatório, resultando num fenótipo idêntico ao induzido pela estimulação destas células com interferão-gama. Tendo em conta que o número de células infectadas com M. tuberculosis H37Ra GFP e com M. smegmatis GFP é semelhante, podemos concluir que as diferenças observadas ao nível dos marcadores de activação resultam, efectivamente, de diferenças de virulência entre ambas as espécies. Por outro lado, a infecção de macrófagos previamente estimulados com interferão-gama (M1), com M. tuberculosis H37Ra, não inibiu a activação destas células, pelo menos ao nível das moléculas apresentadoras de antigénios. Isto sugere que, com uma baixa multiplicidade de infecção, a activação induzida pelo interferão-gama consegue superar os mecanismos inibidores induzidos pelo M. tuberculosis H37Ra, ao nível das moléculas apresentadoras de antigénios. Relativamente às células dendríticas, verificou-se que a infecção com M. tuberculosis H37Ra induz a maturação das células dendríticas imaturas, uma vez que se observou um aumento da expressão das moléculas apresentadoras de antigénios nas células infectadas. Foi também observado um aumento da expressão destes marcadores de maturação, após a infecção com M. smegmatis. No entanto, observou-se uma maior indução da maturação, pela estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra, do que pela espécie saprófita M. smegmatis. As diferenças na virulência entre estas duas espécies poderão justificar o facto da infecção com M. tuberculosis H37Ra ser muito mais estimulatória do que com M. smegmatis. Estas evidências levam-nos a especular que a maturação das células dendríticas, observada após a infecção com M. tuberculosis H37Ra, poderá representar uma forma da micobactéria tirar partido das características migratórias das células dendríticas maturas e assim se disseminar pelo hospedeiro. Outra possível explicação seria que a indução da maturação pela infecção constitui um mecanismo de defesa do hospedeiro, na medida em que as células dendríticas infectadas representam fortes estimuladores das células T CD4+. Concluindo, verifica-se que a infecção com a estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra induz diferentes fenótipos, de acordo com o tipo de célula hospedeira infectada. Isto provavelmente está relacionado com as diferentes funções dos macrófagos e das células dendríticas na resposta imune contra a tuberculose. Em macrófagos humanos, esta estirpe avirulenta impede a expressão do fenótipo M1, ao nível das moléculas apresentadoras de antigénios, o que indica que provavelmente induz um fenótipo anti-inflamatório. Nas células dendríticas, a indução da maturação após a infecção com M. tuberculosis H37Ra pode reflectir um modo de disseminação utilizado pela micobactéria, ou um mecanismo de defesa do hospedeiro que lhe permita iniciar uma resposta imune celular específica. Para além disto, a infecção M. tuberculosis H37Ra induziu fenótipos distintos nas células imunes, comparativamente a M. smegmatis. Na segunda parte desta tese, foi abordado o papel das catepsinas durante a infecção micobacteriana de macrófagos e células dendríticas. Focámos o nosso estudo nas catepsinas S e B, as quais estão envolvidas na apresentação de antigénios via moléculas MHC classe II. A expressão destas catepsinas foi avaliada ao nível das proteínas, em macrófagos e células dendríticas infectados com a estirpe virulenta M. tuberculosis H37Rv ou com a espécie não patogénica M. smegmatis, de forma a analisar se a infecção por micobactérias modula a expressão destas proteases. Demonstrou-se que, em macrófagos M0, a infecção com M. tuberculosis H37Rv diminui a expressão das catepsinas S e B, enquanto que com M. smegmatis não provoca qualquer alteração nestas proteases. Por outro lado, a infecção micobacteriana afectou de forma diferencial a expressão das catepsinas S e B em células dendríticas e macrófagos humanos. Verificou-se que a infecção, tanto com M. tuberculosis H37Rv como com M. smegmatis, parece não interferir com os níveis de catepsina B nas células dendríticas. Relativamente à catepsina S, observou-se um aumento dos seus níveis após a infecção, tanto com M. tuberculosis H37Rv como com M. smegmatis. A infecção de células dendríticas imaturas com a estirpe virulenta resultou num aumento mínimo dos níveis de catepsina S, enquanto que a infecção de células dendríticas maturas resultou num grande aumento dos níveis desta protease. Apesar de não termos uma clara explicação para estes resultados, especulamos que, nas células dendríticas imaturas, M. tuberculosis H37Rv impede o aumento dos níveis de catepsina S, interferindo assim com apresentação de antigénios. Apesar de estas células após a infecção adquirirem um fenótipo de maturas, como anteriormente descrito, as moléculas apresentadoras de antigénios que estas expressam, encontram-se provavelmente num estado imaturo. Por outro lado, as células dendríticas maturas parecem ser capazes de superar este efeito inibitório e por isso se observa um grande aumento dos níveis desta protease. Em paralelo, fomos também explorar o papel das catepsinas S e B na sobrevivência intracelular de M. tuberculosis em macrófagos. Para isso, monócitos humanos THP-1 foram silenciados para estas catepsinas, através do uso de vectores lentivirais a expressar short hairpin RNAs. Posteriormente, estas células foram diferenciadas em macrófagos e estes foram infectados com a estirpe virulenta M. tuberculosis H37Rv ou com a estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra. Ao analisar os perfis de sobrevivência, verificou-se que o silenciamento da catepsina S aumenta significativamente a sobrevivência intracelular de M. tuberculosis H37Ra, enquanto que parece não interferir com a sobrevivência intracelular de M. tuberculosis H37Rv. Tendo em conta que a estirpe virulenta parece ter a capacidade de manipular a catepsina S em macrófagos humanos, é provável que o seu silenciamento mimetize esta modulação e, como tal, não se observem alterações na sua sobrevivência relativamente ao controlo sem silenciamento. A catepsina S parece ser relevante para o controlo do crescimento intracelular de M. tuberculosis H37Ra, mas enquanto a estirpe virulenta M. tuberculosis H37Rv parece desenvolver um mecanismo para evitar o efeito desta protease, a estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra, parece não desenvolver o mesmo mecanismo de manipulação ou então desenvolve mas é menos efectivo. Foi também demonstrado que o silenciamento da catepsina B em macrófagos aumenta significativamente a sobrevivência intracelular de M. tuberculosis H37Ra e de M. tuberculosis H37Rv. Isto evidencia um papel desta protease no controlo da sobrevivência intracelular de ambas as estirpes em macrófagos. Concluindo, verificou-se que os níveis de catepsina S e B, durante a infecção com M. tuberculosis H37Rv, são diferentes dos observados durante a infecção com M. smegmatis. Para além disso, também se observou que os níveis de catepsina S e B diferem consoante a espécie das células imunitárias infectadas, o que poderá estar relacionado com diferentes cinéticas de acidificação e de actividade proteolítica existentes entre elas. Para além disto, os resultados mostram um papel de ambas as catepsinas no controlo do crescimento intracelular de M. tuberculosis H37Ra e M. tuberculosis H37Rv em macrófagos. Porém, a estirpe virulenta M. tuberculosis H37Rv parece ser capaz de subverter os efeitos bactericidas da catepsina S, ao diminuir os seus níveis proteicos. No entanto, a estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra parece ser mais susceptível aos efeitos de ambas as proteases.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/10078
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