Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/10092
Título: Manipulation of cysteine cathepsins during Mycobacterium tubersulosis infection of human macrophages
Autor: Pombo, João Palma Neves, 1989-
Orientador: Anes, Elsa, 1964-
Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-
Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis
Macrófagos
Expressão génica
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main causative agent of tuberculosis, is among the world’s most ancient and most successful pathogens. Its success can be attributed to its ability to avoid phagosomal destruction, survive and proliferate inside its host cells, of which the most important are the human macrophages. Besides being able to block phagosome-lysosome fusion, Mtb is able to inhibit the expression of lysosomal hydrolases, such as cathepsins. Cathepsins are a major class of lysosomal enzymes which have various functions. One in particular, cathepsin S, has been deeply implicated in peptide processing for antigen presentation, assuming in this way an important role in mediating the innate and adaptive immune responses to external invaders in the human body. In this work we analyzed a putative cathepsin gene regulation mechanism employed by Mtb, making use of miRNAs, small RNAs which post-transcriptionally regulate gene expression. The first part of this work was dedicated to unraveling the effect of Mtb in the expression of cathepsin S and the candidate regulator miRNA-106b-5p (miR-106b-5p) in the context of macrophage infection. We have determined that miR-106b-5p is up-regulated, while cathepsin S is down-regulated during Mtb infection of macrophages, in contrast with the non-pathogenic M. smegmatis which seems to have no effect in either. Bioinformatics data point out that the cathepsin S gene (CtsS) is a target for miR-106b-5p. As such, in the second part of this thesis we experimentally tested this hypothesis. First, the transfection of THP-1 cell line with miR-106b-5p mimics resulted in a decrease of cathepsin S, but not as exacerbated as we expected. The same effect has been reported for proteins that were shown to be very stable along time. Secondly, by using luciferase expression vectors and subsequent luciferase activity assays, we showed that the mRNA of CtsS is indeed a target for miR-106b-5p. Altogether, our results indicate that Mtb inhibits cathepsin S expression via miR-106b-5p up-regulation, during macrophage infection.
A tuberculose é uma doença infecciosa que atormenta a humanidade desde há cerca de 9000 anos. A partir do século XVII, com a industrialização da sociedade e a concentração das pessoas em áreas urbanas, a tuberculose atingiu proporções catastróficas e transformou-se num verdadeiro flagelo, tornando-se numa das principais causas de morte na Europa. Ao longo dos tempos foi ganhando diferentes nomes, tais como tísica pulmonar, ou peste branca. Por ser uma doença tão devastadora e não ter ainda uma cura nessa época, a tuberculose era frequentemente abrangida e descrita em obras de arte e literatura como uma força inescapável do destino, semelhante à própria Morte. Com a descoberta do agente etiológico da doença, bem como o aparecimento dos antibióticos e o melhoramento da higiene e condições sanitárias, a incidência e mortalidade atribuídas à tuberculose começaram a declinar, e a doença foi sendo mantida sob controlo durante o século XX. No entanto, em 1992, a Organização Mundial de Saúde (OMS) declarou o ressurgimento da tuberculose como uma das doenças mais alarmantes a nível mundial: o surgimento e prevalência de estirpes com diversas formas de multi-resistência a antibióticos, e o consórcio oportunista entre o Mycobacterium tuberculosis e o vírus da imunodeficiência humana (VIH), foram as principais causas apontadas para este ressurgimento. Actualmente, a tuberculose é uma das doenças, associada a um agente patológico, que mais mortes causa no mundo; apenas em 2011, 8.7 milhões de pessoas contraíram a doença e 1.4 milhões morreram da doença. O primeiro agente etiológico da tuberculose a ser descoberto, no século XIX, foi o Mycobacterium tuberculosis, um ser procariota pertencente ao filo Actinobacteria. Mais tarde, 6 outras espécies do género Mycobacterium foram identificadas como igualmente capazes de causar a doença em humanos, e hoje integram um grupo designado por complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB); ainda assim, M. tuberculosis é o mais comum agente da doença a nível mundial. O género Mycobacterium, compreende maioritariamente espécies inofensivas e saprófitas, contendo apenas um pequeno número de espécies patogénicas, de entre as quais se pode listar M. leprae e M. ulcerans, agentes causadores da lepra e da úlcera de Buruli respectivamente, para além de M. tuberculosis. As micobactérias do CMTB estão entre os patogénios mais bem sucedidos do mundo. Grande parte deste sucesso pode atribuír-se à sua capacidade de conseguirem sobreviver dentro dos macrófagos humanos após terem sido fagocitadas. No processo geral de fagocitose em que o conteúdo internalizado é digerido, a maturação do fagossoma consiste numa série de fissões e fusões parciais do organelo com outros, em diferentes estádios de maturação com trocas parciais de componentes membranares e do lúmen. Estes fenómenos ocorrem durante o tráfego celular da periferia da célula até à região perinuclear onde existem os lisossomas funcionais e ao longo de elementos do citoesqueleto. Durante o transporte o fagossoma vai maturando, isto é, torna-se competente para fundir com o lisossoma, fusão essa da qual resulta o fagolisossoma, vesícula que contém enzimas hidrolíticas num lúmen acidificado a pH aproximadamente igual a 5, ambiente que proporciona uma forte digestão dos seus conteúdos. O M. tuberculosis e espécies aparentadas conseguem bloquear a maturação do fagossoma e desse modo controlar o seu próprio destino intracelular; estão descritos diversos mecanismos através dos quais estas micobactérias conseguem subverter as etapas da fagocitose em seu favor, e também impedir a sua morte intracelular por apoptose do macrófago infectado, originando uma resposta imunitária exacerbada e desregulada que, em última análise, origina os próprios sintomas da doença. Porém, na maior parte dos casos, e tratando-se de indivíduos à partida saudáveis e imunocompetentes, o sistema imunitário é capaz de controlar a infecção, confinando as bactérias em estruturas histológicas pulmonares denominadas granulomas; deste modo, diz-se que há uma infecção latente, em que a bactéria está viva e dentro do organismo, mas não causa sintomas de doença. Vários factores, tanto fisiológicos como imunitários, podem então desencadear o desenvolvimento de tuberculose activa a partir de uma infecção latente, ou então fazer com que a infecção primária origine imediatamente uma situação de doença activa. A nível sub-celular, o lisossoma contém vários tipos de enzimas hidrolíticas, de entre as quais se destaca um grupo de proteases denominadas catepsinas. Estas hidrolases lisossomais não só actuam na degradação de proteínas e processamento de péptidos para apresentação de antigénios como contribuem para a remodelação da matriz extracelular e para a reabsorção óssea. A maior parte das catepsinas são proteases de cisteína (catepsinas B, C, F, H, K, L, O, S, V, X e W), sendo duas delas proteases de serina (catepsinas A e G) e outras duas proteases de aspartato (catepsinas D e E). Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA em cadeia simples, compostas por cerca de 22 nucleótidos, que possuem funções de regulação da expressão genética a nível pós-transcricional. Até há cerca de três décadas atrás, o Dogma Central da Biologia estava bem estabelecido: segundo este, DNA origina RNA, e RNA origina proteínas, atribuindo ao RNA um papel simples, intermediário e passivo. A descoberta dos primeiros miRNAs veio revolucionar esta visão e modernizar o pensamento científico em genética, introduzindo pela primeira vez o conceito de um tipo de RNA com funções regulatórias. A biogénese e maturação dos miRNAs é complexa, envolvendo várias etapas de processamento e modificação, desde que são transcritos do genoma até se tornarem maduros e funcionais. Os miRNAs maduros encontram-se associados ao complexo silenciador induzido por miRNA (miRISC), e é nesta forma que exercem a sua função: os miRNAs possuem afinidade para uma sequência de 7-8 nucleótidos contida na região não traduzida a 3’ (3’-UTR) do mRNA dos seus genes alvo, e ao se ligarem ao mRNA através desta sequência, por complementaridade total ou parcial de bases, impedem que ele seja traduzido pelos ribossomas, provocando a sua degradação, ou destabilizando a sua estrutura molecular. O objectivo deste trabalho é investigar uma relação causal entre a infecção de macrófagos humanos por M. tuberculosis, miRNAs, e catepsinas. A catepsina S, uma protease de cisteína, tem sido fortemente implicada no processamento peptídico para apresentação de antigénios através do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II); estudos anteriores já constataram a manipulação desta catepsina por Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) em macrófagos, porém ainda nenhum estudo relacionado com a catepsina S foi feito em M. tuberculosis. Também, experiências preliminares evidenciaram que alguns miRNAs são diferencialmente expressos em macrófagos infectados com M. tuberculosis, entre os quais o miRNA-106b-5p (miR-106b-5p). Por análise bioinformática foi possível prever que o gene da catepsina S humana (CtsS) é um potencial alvo para o miR-106b-5p; deste modo, a hipótese de um modelo de regulação génica, durante a infecção, baseado na manipulação do miR-106b-5p e consequente alteração da expressão de CtsS, pode ser explorada. Na primeira parte do trabalho explorámos a existência ou não de associações entre M. tuberculosis e CtsS, e entre M. tuberculosis e o miR-106b-5p, no contexto da infecção. Numa triagem preliminar, usámos uma biblioteca de lentivírus para silenciar macrófagos, diferenciados a partir de células monocíticas da linha celular THP-1, para as diferentes catepsinas. As linhas celulares slenciadas para cada catepsina foram então infectadas com a espécie não patogénica M. smegmatis, e a sobrevivência intracelular das bactérias foi analisada através do método das unidades formadoras de colónias (CFUs). Os resultados mostram que várias catepsinas, incluindo a catepsina S, possuem um efeito bactericida induzindo a morte intracelular de M. smegmatis. De todas as catepsinas testadas procedemos a um estudo dirigido à função da catepsina S no contexto da infecção por um patogénio, o M. tuberculosis, e, no seguimento dos dados bioinformáticos que indicavam uma potencial regulação da catepsina S pelo miR-106b-5p, observámos que a expressão de catepsina S em macrófagos infectados com M. tuberculosis é marcadamente reduzida em comparação com macrófagos não infectados ou infectados com M. smegmatis. Estabelecemos ainda a relação com a expressão genética do miR-106b-5p que em macrófagos infectados com M. tuberculosis está claramente sobre-expresso, comparativamente com os infectados com M. smegmatis. Concluímos que os mecanismos de virulência do M. tuberculosis controlam o aumento na expressão genética do miR-106b-5p, acompanhado de uma redução da quantidade de proteína da catepsina S, durante a infecção em macrófagos humanos. Em seguida procurámos averiguar experimentalmente os dados bioinformáticos preditivos que obtivemos para o miR-106b-5p, ou seja, se o mRNA CtsS é realmente um alvo para este miRNA. Transfectámos macrófagos humanos com mimetizadores do miR-106b-5p para exacerbar o efeito do miRNA e avaliar os efeitos na quantidade de catepsina S. Os resultados mostram uma redução na quantidade de proteína catepsina S em macrófagos transfectados com os mimetizadores que não é muito exacerbada, mas que existe; o mesmo tipo de efeito tem sido reportado quando as proteínas celulares são estáveis, não se esperando valores diferenciais maiores que 20%. De seguida demonstrámos o efeito do miR-106b-5p sobre o seu alvo putativo, o mRNA do gene CtsS. Para estas experiências foram usados vectores plasmídicos produtores de luciferase, dentro dos quais foi clonado um fragmento da 3’-UTR do gene CtsS contendo uma cópia da sequência alvo do miR-106b-5p; este fragmento foi inserido a jusante do gene da luciferase no vector, e desse modo, ao ser transcrito, o mRNA do gene da luciferase irá também conter o fragmento clonado. Os vectores recombinantes obtidos desta forma foram então transfectados para células da linha HEK 293T juntamente com mimetizadores do miR-106b-5p; posteriormente, estas células foram lisadas para ser realizado um ensaio de leitura da actividade da luciferase nestas condições. Os resultados que obtivemos indicam uma redução da actividade da luciferase na presença do mimetizador do miR-106b-5p, em comparação com o controlo em que se transfectou com o vector mas sem o mimetizador. Uma redução na actividade da luciferase nestas condições significa que o mimetizador bloqueou a tradução do mRNA do gene da luciferase, fazendo com que este não fosse traduzido para proteína; sendo assim, com esta experiência foi possível concluir que o gene CtsS humano é um alvo para a regulação genética mediada pelo miR-106b-5p. O trabalho reflectido nesta tese permitiu-nos esclarecer os alicerces principais do modelo inicialmente proposto: determinámos que, durante a infecção em macrófagos, M. tuberculosis provoca um aumento na expressão do miR-106b-5p e uma diminuição na expressão da catepsina S. Demonstrámos que o mRNA CtsS é um alvo para o miR-106b-5p, e que a redução da catepsina S durante a infecção se deve, pelo menos em parte, à acção regulatória do miR-106b-5p, que se encontra sobre-expresso. Deste modo contribuímos para decifrar parte da complexidade de mecanismos que as micobactérias do CMTB realizam para sobreviverem dentro do seu hospedeiro humano.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/10092
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
ulfc103226_tm_joao_pombo.pdf967,27 kBAdobe PDFVer/Abrir


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.