Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/10272
Título: Subcellular localization of adenosine A2a receptors in hippocampal synapses
Autor: Carvalho, Sara Alexandra Fernandes
Orientador: Meireles, Margarida, 1955-
Lopes, Luísa Maria Vaqueiro, 1975-
Palavras-chave: Adenosine
A2a
Receptors
Hippocampus
Synaptosomes
Pre-synaptic
Post-synaptic
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: A adenosina é um metabolito existente em todas as células e, tem um papel importante na função neuronal. Actualmente crê-se que este metabolito tem não só um papel como neuromodulador, mas também como regulador homeostático. O conceito de neuromodulador está relacionado com a capacidade de uma substância endógena, libertada na fenda sináptica, influenciar a libertação (modulação pré-sináptica) ou a acção (modulação pós-sináptica) do neurotransmissor. A adenosina é considerada um neuromodulador, na medida em que é responsável pela modulação da libertação de neurotransmissores, resposta pós-sináptica, bem como a acção de outros sistemas de receptores. Este metabolito é também um regulador homeostático pois, está envolvido na síntese de ácidos-base, metabolismo de aminoácidos e modulação do status metabólico da célula. Em condições normais, a adenosina é sintetizada tanto a nível intra como extracellular. A família de receptores ligados a proteínas G, é a família de receptores aos quais a adenosina se liga, sendo conhecidos quatro tipos de receptores de adenosina: A1, A2A, A2B e A3 mas, neste trabalho irão ser apenas estudados os A2A. Os receptores A2A, ao contrário dos A1, apresentam uma restrita distribuição no cérebro, sendo característicos de regiões ricas em dopamina, sendo expressos nos neurónios GABAérgicos do corpo estriado. Através de estudos de imunohistoquímica, baixos níveis destes receptores foram detectados no hipocampo. Mesmo apresentando uma baixa expressão e densidade, estes são importantes nesta área do cérebro, desempenhando um papel importante na modulação da transmissão sináptica. É ainda importante salientar que, nesta área do cérebro os receptores encontram-se essencialmente nos terminais nervosos. Os receptores de adenosina A2A têm ainda a particularidade de produzirem efeitos excitatórios, levando a uma activação da adenilato ciclase, a um aumento do AMP cíclico (cAMP) e a uma activação da proteína cinase A (PKA), culminando na promoção da libertação de glutamato. Existem evidências de que um aumento dos níveis de expressão e função destes receptores A2A, a nível do córtex e hipocampo, está associado a disfunção da função sináptica. Esta disfunção é também acompanhada por diminuição do desempenho em testes comportamentais em tarefas dependentes de hipocampo. No entanto, não se sabe se esses défices observados são gerados graças à sobreexpressão pré- ou pós-sináptica dos receptores A2A. Assim, o objectivo deste trabalho foi o de estudar em que região/área do cérebro ocorre a sobreexpressão dos receptores de adenosina A2A. Levaram-se a cabo estudos de imunohistoquímca em secções de cérebro, e avaliou-se a localização subcellular dos receptores de adenosina A2A usando técnicas de fraccionamento cellular e Western Blot. Para tal, o modelo utilizado foi o de ratos Sprague-Dawley transgénicos (8-16 semanas de idade), que sobreexpressam o receptor A2A humano nos neurónios, sob o controlo do promotor CAMKII (CAMKII-hA2A), e respectivos controlos wild type. Estes ratos apresentam défices de memória e de aprendizagem sendo apropriados para o objectivo do estudo. Nos estudos de imunohistoquímica foram usadas secções coronais de cérebro, seccionadas no crióstato (20 μm) após um processo de perfusão, fixação com paraformaldeído e por fim gelatinização. Depois de cortadas, foram marcadas com um anticorpo específico para neurónios (Microtuble Associated Protein - MAP-2), núcleos (Hoechst) e para o receptor de interesse A2A. Apesar da fraca marcação dos receptores A2A, nota-se uma preferência de expressão dos receptores em torno dos corpos cellulares e ao longo dos neurónios (marcados com MAP-2). Para os estudos da localização subcellular, recorreu-se a sinaptosomas plaqueados de hipocampo dos mesmos animais. Estas estruturas funcionam como um modelo de neurónio pré-sináptico, contendo o terminal pré-sináptico completo, a membrana pós-sináptica e a densidade pós-sináptica. Após a preparação dos sinaptossomas, procedeu-se a um ensaio de imunocitoquímica, onde os terminais pré-sinápticos foram marcados com sinaptofisina,uma proteína localizada nas vesículas sinápticas. A fracção pós-sináptica foi marcada com Post-Synaptic Density Protein (PSD-95), uma proteína pós sináptica, característica dos terminais glutamatérgicos. O número de elementos marcados com sinaptofisina foi considerado como o número total de sinaptossomas. No hipocampo, a preparação de animais transgénicos possui 53.8±7.8% (n=4) de receptores A2A em relação aos wild type - 10.5±6.1% (n=4). Detectou-se uma percentagem de receptores A2A co-localizados com sinaptofisina de 39.3±6.7% (n=4) nos ratos transgénicos, e de 10.5±4.0% (n=4) dos ratos wild type. Os ratos transgénicos têm 10.8±2.3% (n=4) de receptores de adenosina A2A co-localizados com PSD-95, comparando com 3.0±0.4% (n=4) nos wild type. No corpo estriado, observou-se também um enriquecimento de receptores de adenosina A2A de 19.5±8.5% (n=4) nos wild type para 31.7±7.9% (n=4) nos transgénicos. Destes, 16.7±1.8% (n=4) co-localizam com sinaptofisina nos transgénicos e 6.5±1.5% (n=4) nos wild type. Por sua vez, 7.3±4.3% (n=4) dos sinaptossomas co-localizam com PSD-95 nos transgénicos e 6.0±1% (n=4) nos wild type. Para completar os estudos de localização subcellular, foi realizado um protocolo de fracionamento sináptico onde, através de sucessivas centrifugações foi possível fazer um isolamento da fracção pré e pós-sináptica, em estriado e hipocampo de ratos wild type e transgénicos. Analisou-se a presença dos receptores de adenosina A2A em ambas as fracções, por Western Blotting. No hipocampo observou-se, tal como nos ensaios de imunocitoquímica, que os receptores de adenosina A2A são essencialmente pré-sinápticos (3.1±0.9%, n=5) comparando com a presença de receptores a nível pós-sinápticos (2.6±1.6%, n=5). No estriado, observou-se para os receptores de adenosina A2A uma preferência pela localização pós-sináptica (9.6±0.6%, n=2) comparando com a pré-sináptica (2.5±0.6%, n=3). Em conclusão, os resultados deste trabalho mostram que no hipocampo a sobreexpressão dos receptores de adenosina A2A é essencialmente pré-sináptica. Esta localização está de acordo com os estudos funcionais no envelhecimento e em situações de stress crónico onde o aumento pré-sináptico dos receptores de adenosina A2A é apontado como o desencadeador de uma alteração na modulação pela adenosina no hipocampo.
A2A receptors are constitutively activated G-protein coupled-receptors (GPCRs), preferentially expressed by the striatopallidal medium spiny striatal neurons. They exhibit however a very distinct pattern of expression in the hippocampus and cortex where their expression is very low in physiological conditions and mainly in the nerve terminal. Our team and others have found compelling evidence of cortical and hippocampal upsurge of A2A receptors expression/function associated to cognitive deficits. This is accompanied by clear behavioral deficits in hippocampal-dependent tasks, such as spatial memory in rats. However, the mechanism by which A2A receptors dysregulation drives synaptic, cognitive and Alzheimer´s Disease-related pathological hallmarks is unknown; and whether these deficits, are generated by A2A receptors located pre- or post-synaptically remains to be uncovered. We now used transgenic rats overexpressing human A2A receptors in forebrain, under CAMKII promoter (CAMKII-hA2A), which display learning and memory deficits. In order to verify if these deficits are related to pre- or post-synaptic A2A receptors overexpression, we performed a sequential cellular fractionation protocol, using hippocampi derived from wild type (wt) and transgenic (tg) male rats. We were able to efficiently separate the pre- and post- synaptic fractions, as assessed by obtaining exclusive positive Synaptosomal-Associated Protein 25 (SNAP-25) or PSD-95, respectively. The total level of A2A receptors was increased by 3.3±0.7 fold in tg versus wt rats (n=4). In both wt and tg, A2A receptors were found preferentially located in SNAP-25 positive fractions comparing to PSD-95 positive fraction (3.1±0.9 versus 2.7±1.6%, n=5). As a control, we assessed striatum and as expected we observed a preferential postsynaptic localization both in wt and tg animals. We also confirmed co-localization of A2A receptors with synaptophysin in the hippocampus, by using immmunocytochemistry in plated synaptosomes derived from the same animals (10.5±4.0% versus 39.3±6.7%, n=4). This shows that A2A receptors overexpression in the hippocampus occurs preferentially in the nerve terminal, rather than in the postsynaptic density. The pre-synaptic location of A2A receptors in these animals is in agreement with electrophysiology and behavior results, and follows the age progressive physiological overexpression in the hippocampus.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/10272
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