Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/10793
Título: Hydrogen peroxide modulation of angiogenic factors in tumor cells
Autor: Sousa, Ana Maria Jerónimo Gameiro de
Orientador: Afonso, Carla Sofia Fernandes do Amaral Real, 1976-
Palavras-chave: Bioquímica
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: O desenvolvimento e disseminação de tumores sólidos dependem da formação de uma rede vascular que permita o aporte de oxigénio e nutrientes, através de um processo denominado angiogénese. Este processo é regulado por diversos factores que compõem o microambiente tumoral tais como os níveis de oxigénio, acidificação e stress oxidativo. Sabe-se existir um nível elevado de espécies reactivas de oxigénio no microambiente tumoral que ao promover a desregulação de processos como a proliferação, a motilidade celular, a sobrevivência e angiogénese contribui para a iniciação, progressão e promoção tumoral. Estudos realizados no nosso laboratório demonstraram que a diminuição dos níveis celulares de H2O2, através da sobreexpressão de catalase em células de carcinoma mamário de ratinho 4T1, leva a uma diminuição do recrutamento de células endoteliais e invasão vascular, num modelo de xenotransplante em peixe-zebra. O presente estudo pretende identificar os mecanismos moleculares dependentes do H2O2 responsáveis pela regulação da angiogénese. Para isso analisamos alterações na expressão de genes relacionados com o processo angiogénico em populações de células 4T1 com sobrexpressão de catalase através de transfecção transiente com um plasmídeo que permite a co-expressão de catalase e da proteína reporter mCherry. A análise por PCR-array permitiu identificar vários alvos putativos do H2O2 incluindo efectores da via Notch e várias moléculas antiangiogénicas incluindo o inibidor de angiogénese específico de cérebro 1 (Bai1), a Trombospondina 1 (Thbs1) e o inibidor da metaloproteinase 3 (Timp3). Foi observado por hibridação in situ que as células 4T1 expressam os ligandos Dll4 e Jagged1, o receptor Notch3 e o efector Hes1 mas a sua expressão parece ser independente da sobrexpressão de catálase. Contrariamente aos componentes da via Notch, a expressão das proteínas Thbs1 e o Timp3 mostraram ser regulados pela sobreexpressão de catalase de uma forma não-autónoma e de uma forma autónoma, respectivamente. A baixa expressão de HIF-1α nas condições experimentais deste trabalho indica que a regulação destas proteínas é independente deste factor de transcrição chave na regulação de factores reguladores da angiogénese. Verificou-se também que os níveis de expressão da proteína Bai1 nas células 4T1 são demasiado baixos impossibilitando os estudos subsequentes. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que o nível de H2O2 nas células tumorais é capaz de regular a angiogénese através da modelação da expressão de moléculas anti-angiogénicas, de uma forma independente de HIF-1α. Para além da regulação autónoma da expressão de proteínas pelo H2O2, efeito já observado anteriormente por outros autores, este trabalho revela que a alteração dos níveis de H2O2 numa subpopulação de células tumorais é capaz de condicionar a resposta angiogénica global através de um mecanismo não-autónomo. Assim o conhecimento dos mecanismos moleculares dependentes de H2O2 torna-se essencial para o desenvolvimento de terapias mais eficazes contra o cancro.
The development and dissemination of solid tumors depends upon the formation of a vascular network to supply oxygen and nutrients, through a process called angiogenesis. This process is regulated by several factors which are inherent to tumor microenvironment such as low oxygen levels, acidification and oxidative stress. A high level of Reactive Oxygen Species is known to exist in tumor microenvironment which helps the dysregulation of processes such as proliferation, cell motility, survival and angiogenesis contributing to tumor initiation, progression and promotion. Previous studies in our lab have demonstrated that lowering the cellular levels of H2O2 through overexpression of catalase in 4T1 mouse breast tumor cells, leads to a decrease in endothelial cell recruitment and tumor vessel invasion in a Zebrafish xenotransplant model. The present study aims to identify H2O2 dependent molecular mechanisms responsible for angiogenesis regulation. We analyzed alterations in angiogenesis related gene expression in catalase overexpressing populations of the 4T1 cell line by transient transfection with a plasmid which allows co-expression of catalase and the mCherry reporter protein. Through PCR-array analysis several putative H2O2 targets were identified including Notch pathway effectors and several antiagiogenic molecules including Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (Bai1), Thrombospondin 1 (Thbs1) and Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Timp3). Using in situ hybridization, we found that 4T1 tumor cells express the ligands Dll4 and Jagged1, the receptor Notch3 and effector Hes1 of the Notch pathway but their expression seems to be independent of catalase overexpression. Unlike the Notch pathway components, the expression of Thbs1 and Timp3 were found to be regulated by catalase overexpression in a non-autonomous and an autonomous mode, respectively. The low expression of HIF-1α in the experimental conditions used in this work indicates that the regulation of these proteins is independent from this key transcription factor in angiogenesis regulation. We found that Bai1 expression levels in 4T1 cells are too low to allow for subsequent studies. The results obtained in this work have shown that the level of H2O2 in tumor cells is able to regulate angiogenesis in tumor cells through modulation of antiangiogenic molecules, in an HIF-1α independent manner. Aside from autonomous regulation of protein expression by H2O2, previously described by several authors, this work shows that altering H2O2 levels in a subpopulation of tumor cells is enough to condition the overall angiogenic response through a non-autonomous mechanism. Thus, the understanding of H2O2 dependent molecular mechanisms is essential for developing more efficient antitumor therapies.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/10793
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

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