Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/10824
Título: Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
Autor: Matos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-
Orientador: Moreira, Leonilde M.
Santos, Mário de Almeida, 1955-
Palavras-chave: Simbiose
Fixação de nitrogénio
Plantas leguminosas
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Sinorhizobium meliloti é uma bactéria fixadora de azoto que estabelece simbiose com plantas leguminosas do género Medicago. No decorrer da simbiose, ocorre uma troca de sinais entre a planta e a bactéria, levando à formação de nódulos nas raízes. Este processo tem como objetivo a fixação biológica de azoto surgindo, do ponto de vista agrícola, como uma alternativa ao uso de fertilizantes industriais. O genoma de S. meliloti codifica para inúmeras proteínas RTX, caracterizadas pela presença de sequências nonapeptídicas repetitivas ricas em resíduos de glicina e aspartato, que irão favorecer a ligação ao ião cálcio. Algumas destas proteínas estão implicadas no processo simbiótico mediando a biossíntese e/ou modificação de exopolissacáridos. Muitas ainda estão por caracterizar, apesar de algumas delas apresentarem um fenótipo simbiótico, como é o caso de SMc04171, SMb20079 e SMb20838. Uma mutação no gene SMc04171 origina um menor número de nódulos, enquanto mutações em SMb20079 e SMb20838 parecem afectar a colonização dos mesmos. Tendo estas informações em mente, o objetivo deste trabalho foi caracterizar estas três proteínas. Delineou-se inicialmente uma estratégia para construção de mutantes de eliminação em cada um dos genes, o que constituiria uma vantagem face aos de inserção por serem mais estáveis. Não obstante uma série de passos de clonagem bem sucedidos, nenhum dos mutantes de eliminação chegou a ser obtido. Usaram-se então mutantes de inserção disponíveis para os ensaios conjuntos da estirpe selvagem e mutante de modo a avaliar se uma possível redução de competitividade poderia ser a responsável pelo fenótipo simbiótico anteriormente identificado. Para isso, inocularam-se as raízes de Medicago sativa com os diferentes mutantes e estirpe selvagem nas proporções 10:90, 50:50 e 90:10. Após contagem das unidades formadoras de colónias presentes nos nódulos com 5 semanas de desenvolvimento, os níveis de competição foram semelhantes entre mutantes, independentemente da proporção testada. No caso do mutante SMc04171, a média do número de nódulos foi maior em condições de dominância da estirpe selvagem, resultado que está de acordo com os obtidos previamente. Em estudos anteriores, os nódulos de plantas inoculadas com os mutantes para SMb20079 e SMb20838 não apresentavam células viáveis. Contudo, neste trabalho verificaram-se proporções idênticas de células da estirpe selvagem e mutantes no inóculo inicial e colonização final, o que pode ser explicado pelo fornecimento da proteína RTX extracelular por parte da estirpe selvagem, compensado assim a deficiência imposta pelos mutantes. Para caracterizar a atividade bioquímica das proteínas em estudo, os genes SMb20079 e SMb20838 foram clonados no vetor pWH844. Esta clonagem originou uma cauda His-tag na região N-terminal. Verificou-se que todas as proteínas recombinantes são sobre-expressas em Escherichia coli, ainda que só His-SMb20079 tenha sido purificada até à homogeneidade por cromatografia de afinidade. A migração em SDS-PAGE destas proteínas aconteceu para valores cerca de duas vezes superiores ao seu peso molecular, comportamento característico de algumas proteínas acídicas. Na tentativa de identificar uma possível função destas proteínas, foram pesquisadas as homologias com outras proteínas RTX e foram construídos os modelos das estruturas tridimensionais de cada proteína. Apesar das ferramentas bioinformáticas apontarem para um possível papel na proteólise, na modificação de hidratos de carbono e até mesmo na adesão celular, a função destas proteínas ainda tem de ser determinada.
Sinorhizobium meliloti is a nitrogen fixing bacterium establishing symbiosis with leguminous plants of the genus Medicago. During symbiosis, an intense signal exchange between bacteria and the infected plant occurs, leading to the formation of root nodules. Biological nitrogen fixation takes place in these new organs, emerging as an alternative to the use of industrial fertilizers. S. meliloti has one of the highest numbers of repeats in toxin (RTX) proteins, characterized by having aspartate and glycine-rich nonapeptide repeats involved in Ca2+-binding. Some of these RTX proteins have been implicated in symbiosis by mediating exopolysaccharide biosynthesis and/or modification. Others, despite having a symbiotic phenotype, remain uncharacterized. Such is the case of SMc04171 whose mutation gives rise to fewer nodules, and of SMb20079 and SMb20838 which seem to have a role during nodule colonization. The aim of this work was the functional characterization of these three proteins. The first attempt was the construction of deletion mutants by gene replacement with an interposon cassette. Despite many successful cloning steps, no deletion mutant in any gene was achieved. Since there were insertion mutants available, their co-inoculation with the wild-type strain in ratios 10:90, 50:50 and 90:10 was performed in Medicago sativa roots. Data showed similar competitiveness for each mutant when compared with the wild-type. This can be explained by the fact that these RTX proteins are extracellular and therefore its secretion by the wild-type strain may complement mutant’s deficiency in co-inoculation experiments. The three proteins under study were expressed in E. coli as fusions to a his-tag and protein His-SMb20079 was successfully purified to homogeneity. Despite bioinformatics tools predict that SMb20079, SMb200838 and SMc04171 proteins may have a role in proteolysis, carbohydrate modification or even cell adhesion, the function of these proteins still needs to be determined.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/10824
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