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Título: Pesquisa de compostos com actividade inibidora de bombas de efluxo bacterianas
Autor: Cabral, Vanessa Roque
Orientador: Ferreira, Maria José Umbelino
Viveiros, Miguel
Palavras-chave: Zanthoxylum
Alcalóides benzofenantridínicos
Multirresistência
Inibidores de bombas de efluxo
Teses de mestrado - 2012
Data de Defesa: 2012
Resumo: Esta dissertação teve como principal objectivo o isolamento de compostos com actividade inibitória de bombas de efluxo bacterianas, a partir da espécie medicinal Africana Zanthoxylum capense. Por fraccionamento do extracto metanólico das raízes de Z. capense foram isolados três alcalóides benzofenantridínicos denominados oxiqueleritrina (8), oxinitidina (11) e arnotianamida (12). Isolou-se também um fenil-propanóide, designado (+)-ailantoidiol (1), um linhano, o (±)-siringaresinol (13) e uma amida aromática, a (+)-tembamida (9). De modo a obter novos derivados do fenil-propanóide, o composto isolado em maior quantidade, foram realizadas reacções de esterificação com anidrido acético e cloretos de acilo. Obtiveram-se seis novos derivados diacilados: o diacetato de ailantoidiol (2), o dibenzoato de ailantoidiol (3), o didodecanoato de ailantoidiol (4), o dibutanoato de ailantoidiol (5), o di-(2-etilbutanoato) de ailantoidiol (6) e o di-(3-metilbutanoato) de ailantoidiol (7). A (+)-tembamida foi também esterificada com anidrido acético, donde resultou o acetato de tembamida (10). Os compostos foram isolados utilizando técnicas cromatográficas nomeadamente cromatografia em coluna, cromatografia preparativa em camada fina e cromatografia líquida de alta resolução. A caracterização estrutural foi estabelecida por dados físicos e espectroscópicos (IV, MS, RMN unidimencional 1H, 13C e DEPT, e bidimensional HMQC e HMBC). Numa primeira fase foi efectuado um estudo in vitro de interacção dos compostos (1-13) com alguns antibióticos, numa estirpe bacteriana Gram-positiva (Staphylococcus aureus ATCC 6538) e numa Gram-negativa (Escherichia coli ATCC 25922). Para tal foram determinados valores de concentração miníma inibitória (CMI) dos compostos e antibióticos isoladamente e em combinação. Os resultados mais significativos foram obtidos para a oxiqueleritrina (8) que mostrou um efeito sinérgico com todos os antibióticos testados, diminuindo quatro vezes o valor da CMI da oxacilina em S. aureus e para metade os valores da CMI da eritromicina, da tetraciclina e do brometo de etídeo (EtBr). O diacetato de ailantoidiol (2) também apresentou um forte efeito sinérgico em combinação com o EtBr em S. aureus diminuindo quatro vezes o seu valor de CMI. A capacidade dos compostos (1-13) de inibirem bombas de efluxo foi avaliada utilizando um ensaio semi-automático de fluorimetria em tempo-real, nas estirpes referidas. Foram determinados os valores de fluorescência provocados pela acumulação de EtBr na estirpe, na presença dos compostos. O diacetato de ailantoidiol (2) e o di-(2-etilbutanoato) de ailantoidiol (6) provocaram o maior aumento de acumulação de EtBr no S. aureus, demonstrando serem os mais promissores como inibidores de bombas de efluxo. De acordo com este ensaio o composto 2 deverá potenciar a actividade do EtBr, através de um efeito inibitório das bombas de efluxo, podendo ser promissor em estirpes bacterianas resistentes. A oxiqueleritrina (8) não mostrou aumentar a acumulação do EtBr, logo poderá actuar através de outro mecanismo.
The main goal of this dissertation was to search for compounds able to inhibit bacterial efflux pumps, from the African medicinal plant Zanthoxylum capense. Fractionation of the methanol extract of Z. capense led to the isolation of three benzophenanthridine alkaloids namely oxicheleritrine (8), oxinitidine (11) and arnottianamide (12). It was also isolated one phenyl-propanoid, (+)-ailanthoidiol (1), one lignin, (±)-syringaresinol (13), and an aromatic amide, (+)-tembamide (9). In order to obtain new derivatives, the phenyl-propanoid, isolated in large amount, was esterified using acetic anhydride and several acyl chlorides. Six new acylated derivatives: ailanthoidiol diacetate (2), ailanthoidiol dibenzoate (3), ailanthoidiol didodecanoate (4), ailanthoidiol dibutanoate (5), ailanthoidiol di-(2-ethylbutanoate) (6) and ailanthoidiol di-(3-methylbutanoate) (7) were obtained. Tembamide was also esterified with acetic anhydride, yielding tembamide acetate (10). The compounds were isolated using chromatographic techniques such as column chromatography, preparative thin layer chromatography and high resolution liquid chromatography. The chemical structures were deduced from their spectroscopic data (IV, MS, 1H and 13C NMR, DEPT and 2D NMR experiments - HMQC and HMBC). In a first approach an in vitro interaction study of compounds 1-13 with some antibiotics was performed in Gram-positive (Staphylococcus aureus ATCC 6538) and Gram-negative (Escherichia coli ATCC 25922) bacterial strains. Minimum inhibitory concentration values (MIC) of the compounds and the antibiotics alone and in combination were determined. Oxycheleritrine (8) showed the highest synergic effect reducing 4-fold the value of oxacilin MIC in S. aureus. MIC values of erythromycin, tetracycline and ethidium bromide (EtBr) were also reduced by 2-fold. Ailanthoidiol diacetate (2) reduced 4-fold EtBr MIC in S.aureus. The compounds ability to inhibit bacterial efflux pumps was evaluated by a semi-automated fluorometric method in the strains mentioned above, measuring the accumulation of EtBr in the presence of the compounds. Ailanthoidiol diacetate (2) and ailanthoidiol di-(2-ethylacetate) (6) showed the highest increase of EtBr accumulation in S. aureus. According to this assay, compound 2, that decreased the CMI values of EtBr, may act by inhibiting efflux pumps and might be promising in resistant bacterial strains. Conversely, oxicheleritrine (8) did not increase the accumulation of EtBr, suggesting that it may act by a different mechanism of action.
Descrição: Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
Peer review: yes
URI: http://hdl.handle.net/10451/11231
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