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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/1139

Título: Quality control of gene expression in the mammalian cell nucleus
Autor: Custódio, Noélia Maria Fernandes, 1971-
Orientador: Fonseca, M. Carmo, 1959-
Palavras-chave: Transcrição genética
RNA polimerase II
Núcleo celular
Processamento de RNA
Biologia molecular
Teses de doutoramento
Issue Date: 2008
Resumo: Protein-encoding genes are transcribed in the nucleus by RNA polymerase II as precursor RNAs that undergo extensive processing before being translocated to the cytoplasm for translation by the ribosomes. This spatial and temporal separation between RNA and protein synthesis offers an immense opportunity for regulation and quality control.When this study was initiated it was known from biochemical studies that human ß-globin (HBB) transcripts with mutations that impaired splicing or 3' end formation were unable to be exported to the cytoplasm, a phenotype identical to that seen in ß-thalassemia patients harbouring similar mutations (Antoniou et al., 1998). This result was consistent with the retention in the nucleus of incorrectly processed transcripts. Based on this initial observation we hypothesised the existence of a quality control mechanism to retain the incorrectly processed transcripts in the nucleus and proposed to elucidate the mechanism responsible for the observed retention. The first goal of this work was to determine the intranuclear localisation of the retained transcripts. To address this we used as a model system murine erythroleukemia (MEL) cells stably transfected with either wild-type or processing mutant HBB genes. The experimental approach was based on the direct visualisation of both normal and defective HBB transcripts using fluorescence in situ hybridisation and confocal microscopy. Nuclear transcripts of both wild-type and mutant HBB genes were detected only as intranuclear foci co-localising with the template gene locus. To determine the kinetics of transcript release from the site of transcription the cells were treated with the transcriptional inhibitors actinomycin D, α-amanitin and DRB. These drugs induced the rapid disappearance of nuclear foci corresponding to wild-type HBB RNA. In contrast, pre-mRNA mutants defective in either splicing or 3' end formation and which fail to be transported to the cytoplasm were retained at the site of transcription. These results indicated that the quality control mechanism responsible for the nuclear retention of incorrectly processed transcripts operates at the site of transcription and suggest that splicing and 3' end processing are rate limiting for release of mRNA from the transcription site. The next goal of this work was to determine the molecular players involved in the quality control mechanism that operates at the transcription site. Studies over the past years have indicated that there is extensive coupling between transcription, pre-mRNA processing and nuclear export of mRNA (reviewed by Bentley, 2005). One hypothesis to explain the retention of the mutant transcripts could be the absence of recruitment of proteins essential for the release and/or transport of the transcripts from the gene locus. Alternatively, the retention could be mediated by proteins that are bound to the nascent transcripts and become stalled due to incomplete processing To test the first hypothesis we decided to study the recruitment of exon junction complex (EJC) proteins and mRNA export factors to the retention sites in the nucleus. To achieve this we visualised the distribution of EJC proteins and RNA export factors relative to the sites HBB transcription in the nucleus. Using in situ hybridisation and confocal microscopy, we observed accumulation of EJC proteins (REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1 and Magoh) and core spliceosome components (U snRNPs) at sites of wild-type HBB transcription. This suggests that EJC proteins bind stably to pre-mRNA co-transcriptionally. No concentration of the export factors NXF1/TAP or p15 was detected on nascent transcripts, arguing that in mammalian cells these proteins bind the mRNA shortly before or after release from the sites of transcription. Contrasting with the results obtained in MEL cells expressing wild-type HBB transcripts, mutant pre-mRNA defective in splicing and 3' end processing do not co-localise with SRm160, REF, UAP56 or Sm proteins. These results suggest that the accumulation of EJC proteins at transcription sites requires efficient processing of the nascent pre-mRNA. Although the results obtained do not discard the hypothesis that efficient recruitment of EJC proteins and/or export factors may contribute to the release of the transcripts from the transcription site, further studies are required to conclusively show or discard the involvement of these proteins in transcription site release. In the second hypothesis the best candidate to mediate the retention is the carboxyl-terminal domain (CTD) of the largest subunit of RNA polymerase II (RNA Pol II LS). The mammalian CTD comprises 52 heptad repeats followed by a terminal 10 amino acid motif (Corden et al., 1985). Several reports in the last decade showed that both splicing and 3' end processing factors can associate with the CTD of RNA Pol II (reviewed by Bentley, 2005). Since the processing mutants analysed are able to assemble some processing machinery, the release of the transcripts could be blocked by the stalled or abnormal processing machinery associated with the CTD. In order to test this hypothesis we generated cell lines that express either the wild-type HBB gene or a mutant version defective in splicing and an α-amanitin resistant form of RNA Pol II LS with either 52 (wt), 31 (Δ31) or 5 (Δ5) repeats of the CTD. When these cells were treated with actinomycin D to stop transcription the results showed that a large proportion of the wild-type HBB transcripts made by RNA Pol II with only 31 CTD repearts were retained at the site of transcription. Despite this result we observed recruitment of several EJC proteins, includind Aly/REF, Y14 and SRm160 to the transcription sites and RNase protection assays showed that the HBB transcripts produced by RNA Pol II LS Δ31 are correctly spliced and 3' end cleaved. These results show that the form of RNA Pol II LS with only 31 repeats of the CTD is competent in transcription and processing but fails to allow the efficient release of the transcripts from the transcription site. These results provide evidence that mRNA release from the transcription site requires the heptad repeat structure of the CTD and we propose that the missing heptads in the truncated CTD mutant are required for binding of proteins implicated in a final co-transcriptional maturation of spliced and 3' end cleaved mRNAs into export-competent ribonucleoprotein particles. Eukaryotic RNA polymerase II is a complex enzyme composed of 12 distinct subunits that is present in cells in low abundance (reviewed by Shilatifard et al., 2003). Transcription of mRNA by RNA polymerase II involves a phosphorylation/ dephosphorylation cycle of the CTD of the enzyme's largest subunit. The hypophosphorylated form assembles into pre-initiation complexes and the CTD becomes first phosphorylated on Serine at position 5 of the heptad repeat and during elongation on Serine at position 2 (Komarnitsky et al., 2000; Lu et al., 1991). As mentioned before we have generated stable murine cell lines expressing an α-amanitin resistant form of RNA Pol II LS. The cell lines generated were screened for survival and transcription in the presence of α-amanitin ensuring the functionality of the exogenous subunit. To characterise these cell lines we studied the localisation of the exogenous subunit and observed that over-expressed RNA Pol II LS was predominantly hypophosphorylated, soluble and accumulated in the cytoplasm in a CRM1-dependent manner. Our results further showed that the transcriptionally active form of RNA Pol II LS containing phosphoserine in position 2 of the CTD repeats was restricted to the nucleus and its levels remained remarkably constant. These results suggest that the nuclear-cytoplasmic distribution of RNA Pol II LS may be regulated by shuttling and we propose that this may provide a mechanism to control the pool of RNA polymerase subunits that is accessible for assembly of a functional enzyme in the nucleus.
Nos eucariontes, a transcrição dos genes pela RNA Polimerase II (RNA Pol II) origina moléculas de RNA mensageiro precursoras (pré-mRNA), sendo necessárias várias etapas de processamento até à formação do mRNA funcional que é transportado para o citoplasma, onde serve de molde para a síntese proteica. Essas etapas de processamento consistem em três processos distintos: na adição de uma trifosfoguanosina metilada na extremidade 5' trifosfato, estrutura conhecida como cap; na remoção de sequências não codificantes presentes no pré-mRNA (intrões) e junção das sequências codificantes flanqueadores (exões), num processo designado por splicing; e finalmente na formação da extremidade 3' do mRNA que consiste na clivagem e na adição à extremidade 3'OH resultante, de múltiplos nucleótidos de adenina, num processo designado por poliadenilação. Cada uma destas etapas de processamento é levada a cabo por uma maquinaria própria. No caso da adição do cap são necessárias três enzimas: uma RNA 5' trifosfatase, uma guanililtransferase e uma metiltransferase. O mecanismo de splicing envolve a ligação sequencial ao pré-mRNA de várias partículas ribonucleoproteicas nucleares pequenas (snRNP) que, com o auxílio de vários factores proteicos, formam uma estrutura complexa denominada spliceossoma. A maquinaria de poliadenilação é constituída por vários complexos proteicos, pela polimerase de poly(A) (PAP) e pela proteína nuclear de ligação ao poli(A) (PABPN1, anteriormente designada PABP2) (revisto por Proudfoot et al., 2002). O correcto processamento das moléculas de pré-mRNA é um requisito fundamental para o transporte do mRNA para o citoplasma. Existem evidências de que moléculas de pré-mRNA com mutações nas regiões de consenso 5' e 3' dos seus intrões, que permitem a formação do spliceossoma mas que impedem a remoção dos intrões, são retidas no núcleo, enquanto que moléculas de pré-mRNA com mutações que não permitem a formação do spliceossoma são rapidamente exportadas para o citoplasma (Chang and Sharp, 1989; Hamm and Mattaj, 1990; Legrain and Rosbash, 1989). Do mesmo modo, mutações que interferem com a correcta poliadenilação do pré-mRNA também impedem a sua exportação para o citoplasma (Antoniou et al., 1998). Apesar destes resultados apontarem para a existência, no núcleo, de um mecanismo de controlo da qualidade do mRNA exportado, sabe-se muito pouco sobre o modo como esse controlo é efectuado. Com o objectivo de compreender o mecanismo de controlo de qualidade do mRNA exportado em células de mamífero iniciou-se o estudo da organização intranuclear do RNA da ß-globina humana. O gene da ß-globina humana foi escolhido para este estudo devido ao grande número de mutações pontuais que afectam o processamento do pré-mRNA e que estão na base de uma doença genética designada por ß-talassémia (Antonioiu, 1995). A expressão deste gene está limitada a células da linhagem eritróide, durante o processo de diferenciação (Tang et al., 2002). Assim, como modelo de estudo, utilizaram-se células de eritroleucemia murina (MEL, Murine ErythroLeukemia), que podem ser induzidas a diferenciar-se em cultura e expressar os genes específicos das células eritróides, onde se incluem os genes das globinas. Estas células foram transfectadas de forma estável com o gene da ß-globina humana (ßWT) e com mutantes do referido gene, nomeadamente com mutações que impedem o splicing do segundo intrão (ßSM) e uma mutação que impede a poliadenilação (ßIVSI). Quando este estudo foi iniciado sabia-se que os genes mutados eram transcritos e que o respectivo RNA não se acumulavam no citoplasma das células MEL, ao contrário do que acontecia com o mRNA da ß-globina humana normal (Antoniou et al., 1998). O primeiro objectivo deste estudo foi então determinar a localização nuclear dos transcritos mutados. Para alcançar este objectivo foi optimizada a técnica de hibridação in situ para detecção dos transcritos do gene da ß-globina humana nas células MEL. Esta experiência mostrou que os transcritos do gene normal eram detectados no núcleo, junto ao local de transcrição e acumulavam-se no citoplasma, enquanto que os transcritos dos genes mutados eram detectados apenas junto ao local de transcrição. Para avaliar a cinética de libertação do RNA do local de transcrição foram efectuadas experiências com o inibidor de transcrição actinomicina D. Este inibidor actua muito rapidamente após a sua adição ao meio de cultura (Darnell et al., 1971) e exerce o seu efeito através do bloqueio da elongação, uma vez que se intercala nas moléculas de DNA (Reich and Goldberg, 1964). Após 5 minutos de tratamento com actinomicina D os transcritos do gene da ß-globina humana normal deixaram de ser detectados no núcleo, o que sugeriu que o RNA previamente transcrito já tinha sido libertado do local de transcrição. Por outro lado, os transcritos que têm uma mutação na região de consenso 5' do segundo intrão (ßSM), que permite a formação do spliceossoma, mas inibe o splicing (Lamond et al., 1987) permaneceram junto ao local de transcrição após o tratamento com actinomicina D. Os transcritos que não possuem o segundo intrão (ßIVSI) e por isso não são poliadenilados (Collis et al., 1990) ficaram também retidos no núcleo, junto ao local de transcrição, após o tratamento com actinomicina D. Estes resultados mostraram que os transcritos do gene da ß-globina humana são rapidamente libertados do local de transcrição, enquanto que os transcritos que possuem mutações que impedem o splicing e a poliadenilação ficam retidos próximo do gene, sugerindo que o mecanismo de controlo de qualidade do mRNA exportado actua ao nível do local de transcrição (Custódio et al., 1999). O objectivo seguinte foi determinar qual o mecanismo molecular responsável pelo controlo de qualidade do mRNA ao nível do local de transcrição. Estudos efectuados na última década têm revelado a existência de inúmeras interacções entre a maquinaria de transcrição, de processamento do pré-mRNA e de exportação do mRNA para o citoplasma (ver Bentley, 2005). Uma das hipóteses colocadas para explicar a retenção dos transcritos com mutações junto ao local de transcrição foi a de que neste caso poderia não haver recrutamento de proteínas essenciais para a libertação e/ou transporte do mRNA a partir do respectivo gene. A outra hipótese colocada foi a de que a retenção poderia ocorrer por intermédio de proteínas que estão ligadas aos transcritos nascentes durante o processamento e que se libertam quando este se completa, mas que no caso dos mutantes ficam bloqueadas devido ao facto de o processamento do pré-mRNA não se completar. Para testar a primeira hipótese decidimos estudar o recrutamento, para o local de transcrição, de proteínas que se ligam ao mRNA. Assim testamos o recrutamento de proteínas que se ligam ao mRNA após o splicing, designadas de proteínas do complexo junção de splicing (EJC, exon junction complex), e de factores de exportação do mRNA. Para tal, conjugou-se a técnica de hibridação in situ para detecção dos transcritos com a localização das proteínas em questão (por imunomarcação com anticorpos específicos ou transfecção para expressão de proteína com marcador fluorescente). Assim, efectuou-se detecção de proteínas do EJC (REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1 e Magoh), de componentes do spliceossoma (proteínas Sm e proteína B'' do snRNP U2) e dos factores de exportação do mRNA (NXF1/TAP e p15) simultaneamente com a detecção dos transcritos da ß-globina humana. Os resultados obtidos indicaram que as proteínas EJC e os componentes do spliceossoma são recrutados para os locais de transcrição do gene normal, no entanto, não se detectou acumulação dos factores de exportação junto ao local de transcrição. Estes resultados sugerem que as proteínas do EJC se ligam estavelmente ao pré-mRNA co-transcricionalmete, mas que os factores de exportação se ligam imediatamente antes da libertação dos transcritos do gene ou após estes se terem libertado. Quando se efectuou a mesma análise num mutante de processamento não se detectou recrutamento para o local de transcrição, nem das proteínas do EJC, nem dos componentes do spliceossoma. Estes resultados sugerem que o splicing dos transcritos da ß-globina é essencial para a acumulação das proteínas do EJC no local de transcrição e possivelmente para o posterior direccionamento para a via de exportação do mRNA para o citoplasma (Custódio et al., 2004). Embora os resultados obtidos não descartem a hipótese de que o recrutamento eficiente de proteínas do EJC e/ou de factores de exportação do mRNA possa contribuir para a libertação do mRNA do local de transcrição, são ainda necessários mais estudos para que se possa concluir se estas proteínas desempenham um papel essencial neste mecanismo. Sabe-se que a associação entre a maquinaria de transcrição e a maquinaria de processamento do pré-mRNA é mediada pela extremidade carboxílica da subunidade grande da RNA polimerase II (RNA Pol II LS), normalmente designada de CTD (Carboxyl-Terminal Domain) (revisto por Bentley, 1999). O CTD da RNA Pol II apresenta uma constituição invulgar, sendo formado por repetições em tandem de um heptapéptido com o consenso Tirosina-Serina-Prolina-Treonina-Serina-Prolina-Serina, seguido de um motivo C-terminal constituído por 10 aminoácidos (Corden et al., 1985). O número de heptapéptidos presentes varia entre os eucariontes, apresentando os mamíferos 52 unidades repetitivas (Corden et al., 1985) e as leveduras apenas 26 (Allison et al., 1985). As primeiras evidências para uma ligação entre o CTD e o processamento do pré-mRNA vieram de estudos que apontavam para a exi
Tendo em conta estes dados, a hipótese de que a retenção junto ao local de transcrição pode ocorrer por intermédio de proteínas que se ligam aos transcritos nascentes e não se libertam devido ao bloqueio no processamento do pré-mRNA ganhou um candidato preferencial, o CTD da RNA Pol II. Assim, a retenção poderá ocorrer por intermédio da maquinaria de processamento ineficaz ou inactiva que permanece associada ao CTD da RNA Pol II, pressupondo-se que a maquinaria de processamento se associa ao CTD durante a reacção e se desliga do CTD no final da mesma, permitindo a libertação do RNA para posterior transporte para o citoplasma. No caso dos mutantes, em que ocorre associação da maquinaria de processamento mas a reacção não se completa devido à mutação, o pré-mRNA poderá permanecer ligado ao CTD via essa mesma maquinaria, acabando por ser degradado. Para testar esta hipótese a abordagem experimental escolhida consistiu na construção de um modelo celular onde a transcrição dos genes é efectuada por uma RNA Pol II com delecção parcial do CTD. Esta abordagem é facilitada pela existência de formas da RNA Pol II LS resistentes ao inibidor de transcrição α-amanitina, o que permite anular a RNA Pol II endógena. Foram estabelecidas linhas celulares estavelmente transfectadas com o gene da RNA Pol II LS com 5 repetições no CTD (Δ5), com 31 repetições (Δ31) e com 52 repetições (controlo, wild-type). Foi efectuada uma primeira triagem a estas linhas para avaliar a sua capacidade de transcrever na presença de α-amanitina. Nenhuma das linhas Δ5 testadas apresentou capacidade de transcrever o gene da globina murina ß-major na presença de α-amanitina. Este resultado foi inesperado, uma vez que este mutante já tinha sido utilizado em estudos anteriores, onde foi mostrado que apresentava capacidade de transcrever o gene da ß-globina humana sob controlo do promotor SV40 (McCracken et al., 1997b). No entanto, estudos posteriores onde se analisou a capacidade transcricional da RNA Pol II Δ5 por run-on em mais de 500 genes, indicaram que a este mutante não é funcionalmente activo para a transcrição de genes endógenos (Meininghaus et al., 2000). Estes resultados impossibilitaram a utilização dos clones Δ5 nos estudos posteriores. Das linhas Δ31 e wild-type que apresentaram capacidade de transcrever na presença de α-amanitina foi seleccionada uma para transfecção com o gene da ß-globina humana. Cada uma das linhas foi transfectada quer com a versão normal do gene (ßWT), quer com uma versão que possui uma mutação de splicing (ßSM) para a qual se mostrou anteriormente que há retenção do respectivo RNA junto ao local de transcrição. Os transcritos da ß-globina humana foram detectados no núcleo das células transfectadas como um foco que corresponde ao RNA junto do local de transcrição. Quando se efectuou o tratamento com o inibidor de transcrição actinomicina D os resultados indicaram que uma grande proporção dos transcritos ßWT feitos pela RNA Pol II Δ31 ficavam retidos no local de transcrição. Apesar deste resultado, observou-se recrutamento de proteínas do EJC, incluindo Aly/REF, Y14 e SRm160 para os locais de transcrição. Uma análise bioquímica dos transcritos ßWT feitos pela RNA Pol II Δ31 indicou que sofriam splicing e processamento na extremidade 3' correctamente. Estes resultados indicam que a RNA Pol II LS com apenas 31 unidades repetitivas é capaz de transcrever mas não permite a libertação eficiente do mRNA do local de transcrição. Isto sugere que a estrutura do CTD é importante para a libertação do mRNA do local de transcrição, possivelmente porque assegura o recrutamento de proteínas importantes para uma maturação final do mRNA após o splicing e o processamento da extremidade 3', que o transforma numa partícula ribonucleoproteíca competente para ser exportada. Propomos assim que as unidades repetitivas em falta no mutante Δ31 da RNA Pol II poderão ser essenciais para o recrutamento destas proteínas (Custódio et al., 2007). A RNA Pol II eucariota é uma enzima complexa, composta por 12 sub-unidades distintas, que se encontra presente na célula em níveis relativamente baixos (revisto por Shilatifard et al., 2003). A transcrição do pré-mRNA pela RNA Pol II envolve ciclos de fosforilação e desfosforilação do CTD da sua maior subunidade. O CTD encontra-se hipofosforilado quando a RNA Pol II se liga ao complexo de pré-iniciação e assume uma forma hiperfosforilada quando o transcrito tem cerca de 25 bases (O'Brien et al., 1994). A primeira fosforilação ocorre na Serina que se encontra na posição 5 do heptapéptido e durante a elongação a Serina na posição 2 é fosforilada (Komarnitsky et al., 2000; Lu et al., 1991). Pelas razões já mencionadas, estabelecemos linhas celulares murinas que expressam uma forma da RNA Pol II LS resistente ao inibidor de transcrição α-amanitina. Foi efectuada uma primeira triagem a essas linhas celulares para seleccionar aquelas que apresentavam a capacidade de sobreviver e transcrever na presença da α-amanitina, assegurando que nessas linhas a RNA Pol II LS exógena é funcional. Com o objectivo de estudar a localização sub-celular da RNA Pol II LS seleccionaram-se duas linhas com níveis diferentes de expressão da subunidade exógena. Resultados de imunomarcação e western-blotting indicaram que a RNA Pol II LS sobre-expressa se encontra predominantemente hipofosforilada e se acumula sobretudo no citoplasma. A forma activa (fosforilada na Serina 2 do heptapéptido), pelo contrário, encontra-se exclusivamente no núcleo, em níveis constantes, independentemente do grau de sobre-expressão da proteína. A presença, no citoplasma, da RNA Pol II LS sobre-expressa foi descrita num outro estudo onde se procedeu à sobre-expressão de uma forma conjugada à proteína fluorescente EGFP (Sugaya et al., 2000). Este resultado pode ser explicado por uma importação ineficiente para o núcleo do excesso de proteína produzida no citoplasma, ou por o excesso de proteína que é importado para o núcleo ser posteriormente exportado para o citoplasma. Para investigar a possibilidade da RNA Pol II LS poder deslocar-se do núcleo para o citoplasma comparámos a distribuição sub-celular das formas endógena e exógena sobre-expressa, na presença de leptomicina B (LMB), um inibidor de exportação nuclear dependente do transportador CRM1 (Fornerod et al., 1997; Kudo et al., 1999). Os resultados indicaram que o LMB diminui a acumulação citoplasmática da proteína sobre-expressa e aumenta os níveis nucleares da proteína endógena. Estes resultados indicaram, pela primeira vez, que a RNA Pol II LS tem a capacidade de efectuar um mecanismo de vai-e-vem entre o núcleo e o citoplasma. Propomos que este mecanismo poderá ser um meio a que a célula recorre para regular o número do moléculas desta sub-unidade presentes no núcleo, de modo a manter uma relação equilibrada das várias sub-unidades e assim assegurar a formação de complexos de transcrição funcionalmente activos (Custódio et al., 2006). Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação foi pioneiro na identificação de um mecanismo de controlo de qualidade do mRNA, que actua ao nível do local de transcrição, no núcleo de células de mamífero (Custódio et al., 1999). Este mecanismo evita que moléculas de pré-mRNA com mutações que impedem o seu correcto processamento cheguem ao citoplasma, onde poderiam original proteínas defeituosas com consequências negativas quer para a célula quer para o organismo. O trabalho apresentado foi também o primeiro a mostrar a importância da libertação do mRNA do local de transcrição, actualmente considerada uma etapa importante da síntese do mRNA (ver Vasudevan and Peltz, 2003). Estudos efectuados em S. Cerevisiae vieram mostrar que um mecanismo de controlo de qualidade semelhante também funciona em levedura, onde transcritos com defeitos na poliadenilação ficam retidos no núcleo, ao nível do local de transcrição (Hilleren et al., 2001; Jensen et al., 2001b; Libri et al., 2002; Thomsen et al., 2003). O trabalho aqui apresentado contribuiu ainda para a compreensão do mecanismo responsável pela retenção dos transcritos com defeitos no processamento junto ao local de transcrição. Mostrámos que estes transcritos não são capazes de recrutar eficientemente proteínas do complexo junção de splicing (Custódio et al., 2004) e que o CTD da RNA Pol II desempenha um papel importante na etapa de libertação do mRNA do local de transcrição (Custódio et al., 2007).
Descrição: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas) apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2008
URI: http://sibul.reitoria.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000532476
http://hdl.handle.net/10451/1139
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