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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/1141

Título: Viral immune evasion strategies : the human cytomegalovirus US2 immunoevasin and protein degradation from the endoplasmic reticulum
Autor: Loureiro, Joana, 1978-
Orientador: Simas, João Pedro, 1965-
Ploegh, Hidde L., 1953-
Palavras-chave: Retículo endoplásmico
Citomegalovírus
Sistema imunitário
Proteínas virais
Histocompatibilidade
Linfócitos T citotóxicos
Antigénios
Genética humana
Biologia celular
Teses de doutoramento
Issue Date: 2006
Resumo: Genomas relativamente pequenos e elevadas taxas de replicação permitem a acumulação de mutações a virus e bactérias, que vão assim constituindo novos desafios para o sistema imunitário do hospedeiro. Por outro lado, a resposta imunitária de um hospedeiro progressivamente melhor adaptado, modificada ao longo de uma história de co-evolução, torna a vida do agente patogénico cada vez mais complicada. Não constitui, portanto, surpresa a constatação que micróbios patogénicos procurem evitar detecção ou modular a resposta imunitária do hospedeiro, muitas vezes re-dirigindo vias celulares normais para seu benefício. Os vírus persistentes da familia Herpesviridae como o Citomegalovírus humano (CMVH) são capazes de causar uma infecção vitalícia latente, com reactivação esporádica e controlada em face de um sistema imunitário completamente equipado do hospedeiro saudável. Esta estratégia viral de sobrevivência depende de uma forma crítica de proteínas com funções de imunoevasão ou imunoevasinas , produtos de genes virais dedicados à subversão do sistema imunitário do hospedeiro para escapar eliminação por este último.A via de apresentação de antigéneos pela classe I do complexo maior (ou principal) de histocompatibilidade (MHC) é utilizada pelo sistema imunitário para amostragem do ambiente intracelular. Péptidos antigénicos gerados pela actividade proteolítica do proteosoma citoplasmático são carregados em moléculas da classe I do complexo MHC acabadas de sintetizar no retículo endoplasmático (RE), após o que o complexo trimérico de MHC - composto pela cadeia pesada (CP) de MHC, cadeia leve de MHC e péptido antigénico - é transportado através da via secretora até à superfície da célula, onde é sujeito a escrutínio pelo sistema imunitário. Quando uma célula é infectada por um vírus, proteínas citoplasmáticas de origem viral são sujeitas a degradação pelo proteosoma tal como as proteínas de origem celular, resultando na produção de antigéneos virais que ganham acesso à via de apresentação de antigéneos pela classe I do MHC. Linfócitos T citotóxicos (CTLs) inspeccionam os produtos do MHC à superfície celular para identificação de péptidos antigénicos de origem viral, enquanto que as células natural killer (NK cells) procuram perturbações na expressão de moléculas do complexo MHC à superfície da célula infectada. Detecção quer de antigéneos víricos, quer de perturbações na expressão de produtos da classe I do MHC ambos causados por infecções virais pode conduzir à activação do programa citolítico dos linfócitos T ou das células NK, e, por fim, à destruição da célula que serve de refúgio ao vírus. Porque funciona na amostragem do ambiente intracelular habitado pelos vírus, a via de apresentação de antigéneos pela classe I do MHC representa um desafio formidável para os patogéneos virais e é, não surpreendentemente, alvo de muitas estratégias virais de evasão do sistema imunitário, particularmente pelos vírus da família Herpesviridae. Um deles, o Citomegalovírus humano (CMVH), codifica múltiplas imunoevasinas que interferem com a via de apresentação de antigéneos pela classe I do MHC. Os genes US2 e US11, localizados na região unique short (US) do genoma do CMVH codificam duas glicoproteínas residentes na membrana do RE que catalizam o transporte (logo após a sua síntese) da cadeia pesada (CP) da classe I do MHC (uma glicoproteína transmembranar com topologia de tipo I) através da membrana do RE para o citoplasma, resultando na sua degradação pelo proteosoma uma vez no citoplasma. Este movimento de proteínas do retículo endoplasmático (RE) para o citoplasma, uma vez que ocorre no sentido contrário ao da sua translocação (translocation) aquando da síntese proteica, é designado retro-translocação ou dislocation.O processo induzido pelas proteínas virais apresenta muitas similaridades com mecanismos de controlo de qualidade que operam ao nível do RE e que asseguram a fidelidade e a regulação da expressão proteica durante a vida e a diferenciação celulares. Após inserção na membrana do RE ou translocação para o interior do RE, as proteínas que não atingem os estágios finais de folding (estrutura secundária e terciária) ou assembly (estrutura quaternária, no caso de proteínas que fazem parte de complexos proteicos) são destruídas. Proteínas da membrana ou do lumen do RE que são reconhecidas como misfolded ou misassembled, ou que são reguladas por proteólise em resposta a factores ambientais, são retro-translocadas, atingindo assim o citoplasma onde têm lugar os processos de remoção das cadeias de açúcares (deglycosylation), ubiquitinação, e, por fim, proteólise, através do qual o proteosoma citoplasmático destrói os polipéptidos aberrantes. A maquinaria celular envolvida na extracção de proteínas misfolded ou misassembled encontra-se ainda pouco definida. A degradação das moléculas da cadeia pesada (CP) da classe I do MHC pelas proteínas US2 e US11 não só permite ao CMVH escapar detecção pelo sistema imunitário mas constitui um sistema privilegiado de estudo do processo de retro-translocação, um processo de importância mais generalizada em casos de doenças causadas por acumulação de proteínas misfolded ao longo da via secretora, eliminação de proteínas com folding mais lento ou mais difícil, ou intoxicação celular por toxinas bacterianas ou vírus que têm de ser retro-translocados.A retro-translocação induzida pelas imunoevasinas US2 e US11 é uma reacção (ou conjunto de reacções) única não só em termos da rapidez e da especificidade da degradação causada, mas também porque as moléculas da CP da classe I do MHC não se podem classificar como misfolded ou misassembled nem são degradadas em resposta a sinais normais de regulação celular, mas em resultado da expressão de quer uma quer outra proteína viral. Apesar destas características singulares, o estudo da reacção catalizada pelo virus permitiu a caracterização de importantes pormenores mecanísticos do processo de retro-translocação: o estudo da via de retro-translocação mediada pela imunoevasina US11, em particular, levou à descoberta de componentes deconhecidos da maquinaria celular, as proteínas da família DERLIN, cujo envolvimento mais generalizado na retro-translocação em células não infectadas por CMVH veio, entretanto, a ser demonstrado.Embora tenham como alvo o mesmo substrato (CPs do MHC) e induzam o mesmo cenário (degradação das CPs do MHC), os pormenores mecanísticos das reacções catalizadas pelas duas imunoevasinas virais diferem, por exemplo, a nível da identidade dos alelos de MHC que são alvo de destruição ou dos requisitos em termos do comprimento e da sequência da cauda citoplasmática da CP evidenciados por cada uma das proteínas virais. Nesta tese nós mostramos que as imunoevasinas US2 e US11 diferem também na sua capacidade de usar como alvo de destruição estágios distintos de folding dos produtos do locus MHC. Nós produzimos uma molécula de CP unfolded através de site-directed mutagenesis das duas cisteínas que formam a ponte dissulfídica do domínio alpha 3 situado na região da CP mais próxima da membrana, e mostramos que apenas a imunoevasina US11 é capaz de induzir a degradação deste mutante. O facto de a proteína US11 utilizar como alvo moléculas de CP independentemente do seu estágio de folding/assembly ao passo que a proteína US2 utiliza como alvo apenas estruturas de classe I do MHC no seu estado folded sugere que as imunoevasinas US2 e US11 actuam em diferentes fases da via biossintética das moléculas da classe I do MHC.As diferenças entre as reacções de retro-translocação catalizadas por US2 e US11 estendem-se à maquinaria celular utilizada por cada uma das imunoevasinas virais: a proteína US11 usa o seu domínio transmembranar para recrutar as CPs do MHC para um homólogo humano da proteína Der1p de levedura, e que é essencial para a degradação de um subconjunto de proteínas misfolded do RE. Curiosamente, a proteína Der1-like (DERLIN-1) humana é crucial no caso do US11, mas não é necessária para o processo catalizado pelo US2. Na realidade, as proteínas celulares essenciais para a retro-translocação catalizada pela imunoevasina US2 não foram ainda caracterizadas. Nós realizamos um screen para a sua identificacão através da comparação entre parceiros de interacção de uma molécula de US2 wild type (activa) com os parceiros de interacção de uma molécula de US2 mutante (inactiva) que não é capaz de catalizar a retro-translocação das CPs da classe I do MHC devido à ausência dos aminoácidos que constituem a sua cauda citoplasmática. Nós identificamos assim a signal peptide peptidase (SPP) como um parceiro de associação específico para a forma activa da imunoevasina US2. Nós mostramos que a redução dos níveis de SPP através de RNA interference (RNAi) inibe a retro-translocação catalizada por US2, mas não por US11. Também demonstramos que a imunoevasina US11, capaz de recrutar a proteína DERLIN-1, não recruta a proteína SPP, e vice-versa. Em conjunto com os dados de RNAi, as nossas observações sugerem que as duas imunoevasinas virais recrutam componentes diferentes da maquinaria celular e possivelmente subvertem duas vias distintas de retro-translocação do RE.A proteína signal peptide peptidase ou SPP é uma aspartase da família das presenilinas (envolvidas nos processos de Notch signaling e doença de Alzheimer's) que cataliza proteólise no plano intramembranar e que, como o próprio nome sugere, cliva os fragmentos dos péptidos sinal que são deixados na membrana do RE após clivagem pela signal peptidase. A primeira função atribuída à SPP foi a produção de epítopos (l
Descrição: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007
URI: http://hdl.handle.net/10451/1141
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