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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/1152

Título: Topografia intranuclear da expressão genética
Autor: Levy, Célia da Conceição Vicente Carvalho Semedo, 1967-
Orientador: Fonseca, M. Carmo, 1959-
Palavras-chave: Genoma
Fenótipo
Núcleo celular
Genética médica
RNA mensageiro
Teses de doutoramento
Issue Date: 2007
Resumo: Como está o genoma organizado no núcleo e em que medida essa organização pode influenciar os processos nucleares e, em especial, a expressão genética? Muitos estudos abordaram já a questão da organização da cromatina no núcleo com o intuito de desvendar as complexas relações entre o papel estrutural e o carácter funcional da organização do genoma no núcleo. O estudo aqui apresentado conduziu à elaboração de um modelo capaz de explicar em grande parte a organização encontrada. A remodelação das hnRNPs é uma forma diferente de regulação da expressão genética. As nossas observações poderão ser integradas um modelo de interacções complexas entre splicing, exportação, controlo de qualidade e tradução do mRNA em que a remodelação dinâmica da composição das hnRNPs visa a regulação da expressão genética. A cromatina, quando condensada na preparação para a mitose, é detectada sob a forma de cromossomas discretos, de tamanhos diversos e com um padrão de bandas alternadas. Os limites e a localização das bandas variam com o método de detecção e com o avanço do estado de condensação da cromatina. Bandas detectadas com diferentes métodos não são completamente sobreponíveis e, para o mesmo método de coloração, o número de bandas diminui com o aumento da condensação da cromatina. A alternância de bandas claras e escuras correlaciona-se com características tanto físicas como funcionais, tais como o timing da replicação da cromatina durante a fase S do ciclo celular, com a densidade de elementos repetitivos do genoma, com o conteúdo em GCs, com a presença de genes, com a densidade de expressão genética e outras propriedades que podem alternar ao longo da fibra cromatínica. Uma forma de identificar o bandeamento dos cromossomas é por coloração química. Por exemplo, o bandeamento com corante de Giemsa após breve proteólise dos cromossomas com tripsina dá origem a um padrão de bandeamento muito reprodutível, chamado bandeamento G, o qual é muito usado na coloração de rotina para analisar o cariótipo. A coloração Giemsa foi essencialmente útil para identificar marcos nos cromossomas que servem como referência de localização de sequências específicas. Presentemente, com todo o genoma humano sequenciado, já foi possível fazer corresponder a localização de cada banda com a sequência nucleotídica, identificando com precisão os seus limites. Após a mitose dá-se a reformação do núcleo celular, a cromatina descondensa e distribui-se por todo o nucleoplasma. No núcleo pode observar-se tipos diferentes de condensação da cromatina: a mais condensada encontra-se essencialmente na periferia do núcleo e na periferia dos nucléolos e é denominada heterocromatina, a menos condensada, eucromatina, apresenta-se dispersa pelo nucleoplasma, sempre salpicada por regiões mais condensadas. A heterocromatina inclui a cromatina constitutiva, composta essencialmente pelas regiões de DNA repetitivo também denominado satélite, e a cromatina facultativa que contém poucas regiões codificantes e enriquecida em genes silenciados, por serem específicos de tecido. A heterocromatina constitutiva é constituída pelo DNA presente nas bandas C dos cromossomas, ou centroméricas, e a heterocromatina facultativa pelo DNA das bandas G. A eucromatina é rica em genes, inclui os genes de manutenção celular (housekeeping) e os genes específicos de tecido, e corresponde às bandas R dos cromossomas. A heterocromatina tem um papel silenciador da expressão genética. Este foi primeiro mostrado pelo efeito PEV, em células de Drosophila. Outros exemplos de inactivação da expressão genética, por localização tridimensional próxima de regiões de heterocromatina foram demonstrados em células de mamífero. Durante os processos de desenvolvimento embrionário e de diferenciação celular há alterações profundas dos padrões de expressão genética: são activados genes específicos e inactivados muitos outros; e observa-se, fundamentalmente, uma relocalização dos genes em relação às regiões heterocromáticas. Supõe-se, pois, que a localização subnuclear seja um factor importante na regulação da expressão genética. Estudos sobre a mobilidade da cromatina, em células vivas, mostraram que as regiões heterocromáticas são quase imóveis, enquanto as eucromáticas apresentam uma mobilidade com restrições, o que sugere um papel estruturante fundamental para a heterocromatina.Nós perguntámos quais seriam as leis que governam a localização das regiões heterocromáticas no núcleo celular. Para alcançar a resposta estudámos a relação de proximidade entre cada par de centrómeros e a periferia nuclear e/ou a periferia dos nucléolos. Uma vez que as regiões repetitivas que flanqueiam os centrómeros de cada cromossoma apresentam variações de sequência que as tornam únicas, foi possível usar sondas específicas para detectar as regiões satélite características da região centromérica de quase todos os pares cromossómicos, por FISH. A periferia do núcleo foi imunodetectada por anticorpos específicos da lâmina nuclear e os nucléolos foram detectados por FISH com uma sonda específica para o RNA ribossómico. Os nossos resultados mostram, primeiro, que existe uma diferença muito acentuada entre os padrões típicos de localização de cada par centromérico e, depois, que cada centrómero tem um comportamento independente do do seu par, o que sugere que a sua localização intranuclear é regida por propriedades que lhe são intrínsecas. Tendo testado uma gama abrangente de diferentes propriedades cromossómicas, encontrámos uma forte correlação entre a frequência de localização junto do invólucro nuclear e o teor de bandas G mais escuras na proximidade dos centrómeros. Como corolário do nosso trabalho sugerimos que a associação das regiões cromossómicas de heterocromatina facultativa, que são contrastadas como bandas G mais escuras em metafase, ao invólucro nuclear, tenha um efeito coesivo em relação às bandas C, de heterocromatina constitutiva, para que também estas se localizem na periferia do núcleo. Este modelo defende que não é uma característica do próprio centrómero que determina a sua disposição no núcleo mas sim as características da cromatina que o flanqueia, prevendo que numa translocação cromossómica o centrómero do cromossoma translocado passará a ter um padrão de localização diferente do do cromossoma normal, influenciado pelo novo contexto cromatínico em que se encontra. Fizemos a validação do nosso modelo estudando a translocação do cromossoma 11 com o cromossoma 14 (t(11;14) e os resultados confirmaram as nossas previsões. Está bem documentada na literatura a relocalização de centrómeros entre periferia nuclear e periferia nucleolar em processos de diferenciação celular e em estados patológicos, bem como a especificidade de tipo celular para o padrão de localização de centrómeros específicos e a espantosa constância de padrão em cada tipo celular quando se comparam espécies animais diferentes. Fazendo uma extrapolação dos nossos resultados, é possível que as grandes alterações na localização preferencial dos centrómeros estejam intimamente relacionadas com a extensa remodelação da cromatina que ocorre fisiologicamente nos processos de diferenciação celular e de forma coerciva em diversas patologias. Nas células eucariotas os genes são transcritos no núcleo originando RNAs precursores de RNAs mensageiros, ou pré-mRNAs. Ainda no local de transcrição, o RNA é processado de forma a tornar-se num mRNA maduro, pronto para ser exportado para o citoplasma. Enquanto é transcrito, vão-se-lhe associando proteínas específicas, formando uma partícula ribonucleoproteica. São as proteínas associadas que determinam o seu processamento de forma a tornar-se um mRNA maduro, e também a sua longevidade e a sua localização de destino no citoplasma, regulando ainda a sua taxa de tradução. É particularmente importante, neste contexto, um subconjunto específico de proteínas que forma o complexo de junção de exões (EJC), uma marca de localização da junção entre dois exões consecutivos, resultante da remoção do intrão que se interpunha entre eles. Esta marca proteica mantém no mRNA a memória de um processo de splicing bem resolvido. Proteínas identificadas como integrantes desta marca incluem SRm160, RNPS1, Y14, Mago, DEK, REF/Aly, e UAP56. Muitas destas proteínas terão sido anteriormente identificadas como componentes de processos tão diversos como a regulação da transcrição, do splicing, do processamento da extremidade 3' do RNA, ou ainda da sua degradação prematura por NMD, da sua localização no citoplasma e da sua tradução.A exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma envolve a interacção específica da partícula ribonucleoproteica que contém o mRNA com factores que facilitam a sua translocação através do poro nuclear. As proteínas TAP/NXF1, p15/NXT1 e Dbp5 foram identificadas por estarem envolvidas neste processo de translocação. Sugere-se que a exportação do mRNA seja potenciada pela associação entre as proteínas do EJC com as proteínas transportadoras. Será que esta associação se estabelece ainda no local de transcrição de uma forma que é simultânea com o processamento do RNA ou far-se-á apenas após a libertação do mRNA do local de transcrição, quiçá junto ao poro nuclear, justamente para o processo de translocação? Para abordar este problema usámos o modelo de infecção de células HeLa com adenovírus Tipo 2, Ad2. No início da fase tardia da infecção, após a grande taxa de replicação do DNA genómico viral resultar na acumulação de DNA genómico viral em estruturas com a forma de cálices, quase todo o genoma viral começa a ser expresso, o que
In the post-genomic era we are still far from understanding how the linear sequence of the DNA determines all aspects of life. Chromosome territories are non-randomly positioned in the cell nucleus. The relative arrangement between genome regions affects genome stability and regulation of gene expression. Centromeres of human chromosomes are frequently found at the nuclear periphery or close to nucleoli, with a non-random distribution, which rules remain elusive. We made a near exhaustive survey in localizing individual centromeres in nuclei of human lymphoid cells. Our results show that the centromeres of homologous chromosomes are independently localized in the interphase nucleus and there is a unique distribution for most pair of centromeres. Based on mathematical analysis we proposed a model that predicts the distribution of centromeric heterochromatin for each individual chromosome, in witch is the proximity of G-dark bands that preferentially locate centromeres at nuclear periphery. The study of a translocation validated our model. Gene expression can be silenced by proximity to heterochromatin and activated by remodelling of chromatin. Remodelling hnRNPs is another different way of expression regulation. Multiple evidences indicate an extensive coupling between nuclear export of mRNA and pre-mRNA processing. The Exon Junction Complex (EJC) is a mark apposed on correctly spliced transcripts. We visualized, for the first time, accumulation of the EJC proteins, REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1, and Magoh at sites of abundant transcription, suggesting a stable co-transcriptional binding to pre-mRNA. The export factors NXF1/TAP, p15, and Dbp5 were not co-localized with nascent transcripts, suggesting an association shortly before, or only after, mRNA release from the sites of transcription. Our results can contribute to an integrated model linking mRNA transcription to splicing, export, surveillance and translation, based on a dynamic and tightly regulated process of remodelling hnRNPs composition to achieve gene expression regulation.
Descrição: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas) apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2008
URI: http://sibul.reitoria.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000528563
http://hdl.handle.net/10451/1152
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