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Título: Triazene prodrug synthesis for MDEPT strategy and their hepatotoxic evaluation
Autor: Santos, Fábio Miguel Figueiredo
Orientador: Francisco, Ana Paula
Perry, Maria de Jesus
Palavras-chave: Melanoma
Tyrosinase
Prodrug
Triazene
MDEPT
Hepatotoxicity
Teses de mestrado - 2011
Data de Defesa: 2011
Resumo: A new serie of anti-tumor triazene prodrugs was synthesized and evaluated concerning their potential application in melanocyte-directed enzyme prodrug therapy (MDEPT). MDEPT strategy emerged to overcome the selectivity and toxicity problems associated with melanoma chemotherapy and is based on the use of non-toxic prodrugs that will be selectively activated by tyrosinase overexpressed in malignant melanocytes, releasing a potent cytotoxic agent inside tumour cells. The synthesized prodrugs 21 are formed by an alkylating agent, the monomethyltriazene 23 (MMT), linked to a tyrosinase substrate, the hydroxyphenylpropionic acid 24, by an amide linkage. In the synthesis of prodrugs 21, the amide-bond formation was tried with different methodologies, which involved carboxylic acid activation. The most efficient methods were O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluroniumtetrafluoroborate (TBTU) assisted by microwave irradiation (20% yield) and N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide/4-dimethylaminopyridine (DCC/DMAP) (15% yield). Prodrug synthesis was achieved with yields that did not exceed 20 %. All prodrugs 21 revealed to be chemically stable in isotonic phosphate buffer (PBS) at physiologic pH (60 ≤ t1/2 (h) ≤ 123), and most of them showed to be slowly hydrolyzed in human plasma (3 ≤ t1/2 (h) ≤ 49). Only prodrugs 21c-f (3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid derivatives) revealed to be excellent tyrosinase substrates (1.5 ≤ t1/2 (min) ≤ 5) with a fast release of MMT 23 after 250 seconds of tyrosinase activation. The maximum percentage of glutathione depletion (GSHdepletion (%)) induced by prodrugs 21, when they were metabolized into cytotoxic quinones by rat liver microsomes, ranged from 34.6 ± 8.6 to 43.6 ± 2.0 for prodrugs 21c-f and was 45.7 ± 5.0 and 63.5 ± 5.0 for prodrugs 21a,b (3-(3-hydroxyphenyl)propionic acid derivatives), respectively. Prodrugs 21c-f revealed to be less hepatotoxic than prodrugs 21a,b. Prodrugs 21c-f are also less hepatotoxic than similar compounds described in the literature, which were evaluated by the same type of assay. Triazene prodrugs 21c-f are promising for application in MDEPT strategy, as they have a great stability, an excellent tyrosinase affinity, an efficient mechanism of MMT 23 release and a moderate hepatotoxicity.
O cancro de pele pode-se manifestar de diversas formas, sendo o melanoma a forma mais agressiva deste tipo de cancro. Apesar do melanoma representar apenas 11% de todos os cancros de pele diagnosticados, é responsável por 90% das mortes associadas a este tipo de cancro. Segundo o Institute of Cancer Research a incidência do melanoma tem tendência a triplicar nos próximos 30 anos, sendo a mudança climática, a principal causa deste aumento. A taxa de mortalidade do melanoma é tão elevada, pelo facto de este ter a capacidade de metastizar e invadir diversas partes do corpo. Este processo de metástase dificulta muito o desenvolvimento de uma terapêutica eficaz para o melanoma. O aparecimento do melanoma deve-se à transformação dos melanócitos normais em malignos. O risco de ocorrer esta transformação pode ser aumentado devido a factores genéticos (ex: mutação num gene supressor de tumores) ou ambientais (ex: exposição a radiação ultravioleta A e B). Nos melanócitos malignos, o processo de melanogénese encontra-se aumentado e os níveis da enzima tirosinase, que é essencial neste processo, estão muito acima dos níveis detectados nos melanócitos normais. Tendo em conta que a tirosinase só se encontra nos melanócitos, e que está sobre-expressa nos melanócitos malignos, esta tem sido considerada como um possível alvo para uma quimioterapia mais selectiva e menos tóxica. A tirosinase tem como principais substratos os monofenóis e os o-difenóis, mas também tem a capacidade de oxidar outros tipos de compostos fenólicos e até não fenólicos. Alguns compostos aromáticos como por exemplo as o-diaminas, os o-aminofenóis e até as anilinas são referidos como substratos desta enzima. Encontram-se descritas na literatura, duas abordagens para o tratamento de melanoma, onde a tirosinase é responsável pela libertação/formação de um agente citotóxico no tumor. Uma dessas abordagens é a melanocyte-directed enzyme prodrug therapy (MDEPT). A estratégia MDEPT envolve o uso de pró-fármacos não tóxicos, formados pelo fármaco citotóxico ligado a um substrato da enzima tirosinase. Deste modo o pró-fármaco só é activado na presença da tirosinase, libertando-se assim o agente citotóxico em grande quantidade no tecido tumoral. A dacarbazina 1 (DTIC) foi aprovada em 1975 pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento do melanoma, e actualmente ainda é o composto mais efectivo em monoterapia para o tratamento deste cancro. A DTIC 1 pertence à classe dos triazenos, mais especificamente aos 1-aril-3,3-dialquiltriazenos, e o seu mecanismo de citotoxicidade envolve a formação de uma espécie alquilante, o ião metildiazónio, que vai alquilar as bases púricas e pirimídicas do ácido desoxirribonucleico (ADN) e assim induzir a morte celular. Nesta tese de mestrado, uma nova serie de pró-fármacos de triazenos anti-tumorais foi sintetizada e avaliada em termos de potencial aplicação na estratégia MDEPT. Os pró-fármacos sintetizados 21 são constituídos pelo ácido hidroxifenilpropanóico 24 ligado através de uma função amida ao monometiltriazeno 23 (MMT). A escolha do ácido hidroxifenilpropanóico 24 deveu-se ao facto deste ácido ser um bom substrato da tirosinase. O MMT 23 foi escolhido, uma vez que o seu mecanismo de citotoxicidade envolve o ião metildiazónio, que é o mesmo agente alquilante responsável pela citotoxicidade da DTIC 1. A função amida tem como objectivo dar estabilidade química aos pró-fármacos 21 de modo a manter a citotoxicidade do MMT 23 inactiva até a enzima tirosinase actuar nos pró-fármacos 21. A síntese dos pró-fármacos 21 envolveu a formação de uma ligação amida entre a amina secundária do MMT 23 e o grupo ácido carboxílico do ácido hidroxifenilpropanóico 24. Em geral, as funções amida são sintetizadas a partir da junção de ácidos carboxílicos com aminas, no entanto esta união é muitas vezes um processo difícil e complexo. De modo a superar estas dificuldades, têm sido desenvolvidos vários métodos, nos quais a acilação da amida ocorre com ácidos carboxílicos previamente activados. Usualmente esta activação é realizada através do uso de agentes de acoplamento. Neste trabalho de investigação, a activação do ácido carboxílico 24 foi efectuada com recurso a diversos agentes de acoplamento. Os agentes de acoplamento utilizados foram: N,N'-diciclohexilcarbodiimida/4-dimetilaminopiridina (DCC/DMAP), tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurónio (TBTU), cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolina (DMTMM) e cloreto de tionilo. A formação da ligação amida foi também realizada recorrendo ao uso de irradiação por microondas. Os métodos mais eficientes foram DCC/DMAP e TBTU (irradiação por microondas) com rendimentos de 15% e 20% respectivamente. Os pró-fármacos 21 foram sintetizados com rendimentos que não excederam os 20%. Apesar dos baixos rendimentos, os pró-fármacos 21 foram obtidos com um elevado grau de pureza e em quantidades que possibilitaram a análise dos mesmos para aplicação na estratégia MDEPT. Com o intuito de avaliar os compostos 21 como potenciais pró-fármacos para aplicação na estratégia MDEPT, foram realizados três tipos de ensaios de estabilidade a 37 ºC. O primeiro ensaio foi efectuado em tampão fosfato isotónico (PBS) pH 7,4, no qual se analisou a hidrólise química dos pró-fármacos 21 a pH fisiológico. Todos os pró-fármacos 21 revelaram ser quimicamente estáveis com semi-vidas que variaram entre as 60 e as 123 horas. O ensaio seguinte consistiu no estudo da hidrólise dos pró-fármacos 21 em plasma humano, visto que este contém um conjunto de enzimas que catalisam a hidrólise da função amida. Todos os pró-fármacos 21, com a excepção do 21b (t1/2 ≈ 3 horas), revelaram ser hidrolisados lentamente com semi-vidas que variaram entre as 6 e as 49 horas. Com os resultados obtidos nestes dois ensaios é de esperar que a maioria dos pró-fármacos 21 alcance o tumor sem sofrer uma prematura decomposição. No último ensaio foi avaliada a afinidade dos pró-fármacos 21 para a enzima tirosinase de cogumelo, que serve de modelo para a tirosinase humana, e foi também analisada a eficácia dos compostos 21 no processo de libertação do agente citotóxico MMT 23 após activação pela tirosinase. Os resultados obtidos neste ensaio, revelaram que os pró-fármacos 21a,b (derivados do ácido 3-(3-hidroxifenil)propanóico) têm uma fraca afinidade para a tirosinase com semi-vidas (t1/2 ≈ 20 horas) demasiado longas para terem interesse como pró-fármacos para aplicação na estratégia MDEPT. Já os pró-fármacos 21c-f (derivados do ácido 3-(4-hidroxifenil)propanóico) demonstraram ser excelentes substratos da tirosinase com semi-vidas que variaram entre 1,5 e 5 minutos. A libertação do agente citotóxico MMT 23 foi confirmada, sendo bastante rápida para os pró-fármacos 21c-f, nos quais foi detectada após 250 segundos de exposição destes compostos 21c-f à enzima tirosinase. Os pró-fármacos 21 contêm na sua estrutura uma função fenólica que pode ser oxidada nos hepatócitos por enzimas do citocromo P450, originando quinonas. As quinonas são espécies extremamente reactivas que se ligam facilmente a nucleófilos, tais como a glutationa (GSH), induzindo a sua depleção e promovendo fenómenos de hepatotoxicidade. A avaliação de hepatotoxicidade destes pró-fármacos 21 foi realizada através de um ensaio a 37ºC em que se calculou a percentagem de depleção da GSH (GSHdepleção (%)). Os resultados obtidos revelaram que os pró-fármacos 21a,b (GSHdepleção (%) = 45,7 ± 5,0 e 63,5 ± 5,0, respectivamente) são mais hepatotóxicos que os pró-fármacos 21c-f (34,6 ± 8,6 ≤ GSHdepleção (%) ≤ 43,6 ± 2,0). Observou-se também que a hepatotoxicidade induzida pelos pró-fármacos 21c-f é inferior à observada para a maioria dos compostos análogos que se encontram descritos na literatura, e que foram analisados pelo mesmo tipo de ensaio. Os pró-fármacos 21c-f possuem uma boa estabilidade química, uma excelente afinidade para a tirosinase, um mecanismo rápido para a libertação do MMT 23 e uma hepatotoxicidade moderada, para poderem ser considerados promissores para aplicação na estratégia MDEPT.
Descrição: Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011
Peer review: yes
URI: http://hdl.handle.net/10451/11594
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