Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/11961
Título: From embryonic stem cells to sensory hair cells : a programming approach
Autor: Costa, Aida Isabel Santos, 1984-
Orientador: Henrique, Domingos, 1960-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2014
Células estaminais embrionárias
Células ciliadas auditivas
Factores de transcrição
Ouvido interno
Diferenciação celular
Data de Defesa: 2014
Resumo: It is estimated that 10% of the world population suffers from hearing impairment, and this number tends to rise with the increase in noise pollution and growth of aging population. The most frequent cause is irreversible damage to sensory hair cells (HCs) of the inner ear, which are highly specialized mechanoreceptor cells able to respond to acoustic signals. Non-mammalian vertebrates (fish, amphibians, reptiles and birds) can spontaneously regenerate sensory HCs after damage, but mammals have only limited capacity to replace the lost HCs, and this leads to permanent hearing and vestibular impairments. Available treatments are so far restricted to prosthetics devices, which can provide enormous benefit to those with hearing loss, but are only able to amplify acoustic signals and, therefore, cannot cure deafness. Thus, research aiming to find new therapeutic solutions is highly necessary. New therapeutic approaches involving gene therapy, drug treatments and cell replacement strategies have been actively pursued. However, large numbers of HCs are required to develop these approaches, and this has been a major problem in the field, given the scarcity and difficult access to HCs in the inner ear. Pluripotent stem cells have the potential to differentiate into any adult cell type, and therefore represent an inexhaustible and attractive supply of differentiated cells for in vitro HCs studies and HC replacement therapies. In this thesis, I describe a new method to efficiently generate HCs in vitro starting from pluripotent mouse embryonic stem (ES) cells. I have employed a cellular programming strategy, and succeeded in identifying a combination of 3 transcription factor (TFs) that can directly convert ES-derived progenitors towards HC fate. These in vitro induced HCs express several HC markers and exhibit polarized structures that are highly reminiscent of mechanosensitive hair bundles, with many microvilli-like stereocilia. Overall, I provide transcriptional, morphological and functional evidence that confirm the HC identity of programmed cells. Moreover, combined activity of the 3 TFs induces an efficient HC production that is clearly superior to the efficiency of HC generation reported in previous protocols using mouse ES cells. I also describe several experiments aimed at transplanting the in vitro generated HCs into an in vivo sensory epithelium. The work presented in this thesis shows that HC programming approach is an efficient and reproducible method to generate HCs in vitro. This approach offers huge potential for both clinical (cell replacement therapies) and basic inner ear research (model system for HC studies; i.e. to performed high-throughput drug screenings).
Atualmente, estima-se que 10% da população mundial sofre de danos auditivos, tendendo este número a aumentar como consequência do aumento da poluição sonora e envelhecimento populacional. Uma das principais causas da surdez em seres humanos resulta de lesões irreversíveis nas células sensoriais ciliadas do ouvido interno. Estas células são mecanorreceptores especializados na deteção das vibrações acústicas e na sua transformação em impulsos elétricos. Os anfíbios, repteis e aves regeneram espontaneamente as células ciliadas após uma lesão, mas os mamíferos perderam esta capacidade regenerativa. Esta é a razão pela qual as surdezes são geralmente permanentes e irreversíveis. Os tratamentos existentes limitam-se ao uso de prostéticos, sendo os aparelhos auditivos e implantes cocleares os mais usados para surdezes severas a profundas ou totais. Estes prostéticos têm proporcionado uma recuperação significativa da capacidade auditiva, no entanto os benefícios são limitados apenas a um ligeiro aumento artificial da informação sonora, estando muito longe de oferecer uma audição normal. É portanto necessário desenvolver novas alternativas terapêuticas que possam estimular a regeneração das células ciliadas e consequentemente recuperar a perda auditiva. A investigação em novas terapias para promover a recuperação das células ciliadas quando estas são danificadas ou morrem têm aumentado muito nos últimos anos. Alternativas terapêuticas como a transplantação celular, uso de fármacos e a terapia genética têm sido bastante exploradas. No entanto, esta linha de investigação têm-se deparado com vários desafios que resultam em parte da anatomia complexa do ouvido interno e no escasso número de células ciliadas que normalmente existem neste órgão. Neste contexto o uso de células estaminais embrionárias torna-se mais atrativo porque estas células têm um potencial proliferativo inesgotável e são pluripotentes, ou seja, têm o potencial de se diferenciar em qualquer tipo de célula do organismo (incluindo as células ciliadas). A partir das células estaminais embrionárias é possível criar in vitro uma população de células ciliadas que pode ser usada não só nas transplantações celulares como também em vários estudos in vitro. Nesta tese de doutoramento, eu descrevo o estabelecimento de uma nova metodologia que promove a diferenciação das células estaminais embrionárias em células ciliadas do ouvido interno. As metodologias anteriormente publicadas para este efeito apresentam limitações consideráveis na eficiência da diferenciação das células pluripotentes para células ciliadas, e na reprodutibilidade do protocolo. Nesta tese, é descrito o desenvolvimento de um novo protocolo baseado numa estratégia que oferece uma clara superioridade na produção in vitro de células ciliadas. Esta estratégia envolve a expressão de uma combinação de três fatores de transcrição para programar os progenitores em diferenciação (derivados das células estaminais embrionárias) diretamente em células ciliadas. A identificação destes 3 fatores de transcrição, Gfi1, Brn3c e Math1 foi baseada no papel crucial que eles desempenham durante o desenvolvimento embrionário das células ciliadas do ouvido interno. A ativação conjunta destes fatores in vitro numa população heterogénea de progenitores em diferenciação resulta numa indução direta de células ciliada, que expressam marcadores específicos e apresentam estruturas morfologicamente semelhantes aos estereocilios mecanorreceptores. A caracterização in vitro das células cíliadas induzidas foi feita a nível transcricional, morfológico e funcional. Em todos estes níveis de análise, foram detetadas as características particulares das células ciliadas na população in vitro de células induzidas. Foi portante possível concluir que as células induzidas apresentam uma identidade muito semelhante às células ciliadas. Nesta tese, estudei também o potencial de uma terapia de transplantação celular de células ciliadas in vivo na regeneração de um órgão sensorial do ouvido interno danificado. Estas experiências tiveram um caracter muito preliminar mas permitiram identificar os vários desafios que é necessário ultrapassar para alcançar o sucesso na terapia de transplantação celular. O trabalho apresentado nesta tese descreve pela primeira vez uma nova estratégia de programação celular para gerar facilmente in vitro uma grande quantidade de células sensoriais ciliadas do ouvido interno a partir das células estaminais embrionárias. Esta nova metodologia oferece um enorme potencial, uma vez que pode ser aplicada em diferentes estudos, como sejam estudos que visam estabelecer novas terapêuticas como a transplantação celular, e estudos que tencionam descobrir novos fármacos, ou investigar fundamentos biológicos da formação e funcionamento das células sensoriais ciliadas.
Descrição: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/11961
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