Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/12093
Título: Engineering new strategies to improve pharmacokinetics of therapeutic proteins
Autor: Cantante, Cátia Sofia de Carvalho, 1982-
Orientador: Gonçalves, João, 1967-
Silva, Frederico Nuno Castanheira Aires da, 1974-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Recombinant antibody formats and therapeutic proteins have found increasing applications as therapeutics, e.g. for the treatment of cancer or inflammatory diseases. While whole antibodies have an exceptionally long half-life, small antibody formats and small molecular weight therapeutic proteins often suffer from rapid elimination from circulation. Usually, this involves frequent administration and repeated infusions with the drug application intravenous or subcutaneously, using a slow adsorption into the blood stream. These limitations of small size protein drugs have led to the development and implementation of several half-life extension strategies to prolong circulation of these molecules and thus improve their administration, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Over the recent years, plasma protein binding has been shown to be an effective approach to improve pharmacokinetic properties of short half-life molecules. Within this context, in order to improve the half-life of therapeutic proteins we have investigated new strategies based on protein fusions with two albumin-binding domains (ABDs) from streptococcal cell surface proteins. These two ABDs were the Zag and protein H (ProtH) derived from Streptococcus zooepidemicus and Streptococcus pyogenes, respectively. To validate our ABDs half-life strategy and as a proof-of-concept, the Zag and ProtH domains were fused with an anti-TNFα VHH single-domain antibody. Our results showed that Zag and ProtH ABDs alone and fused to the anti-TNFα VHH could be stably produced in vitro, present nanomolar binding to human, rat and mouse albumins, quantified by ELISA, and for VHH-Zag, using surface plasmon resonance (SPR). VHH, VHH-Zag and VHH-ProtH proteins presented high thermal properties, and human and mouse serum stabilities as well. Moreover, the fusion of the ABDs with the anti-TNFα VHH did not affect the efficacy of the therapeutic molecule against TNFα. Furthermore and importantly, fusion with Zag and ProtH domains strongly increases the half-life and stability of the anti-TNFα VHH. Comparing with the VHH (terminal half-life of 47 min), VHH-Zag (terminal half-life of ~31 h) and VHH-ProtH (terminal half-life of ~21 h) presented prolonged circulation times of 39-fold and 26-fold, respectively. Therefore, after injection, the residence in mouse serum presented higher time extensions until 72 h for VHHZag and 48 h for VHH-ProtH (versus 2 h exhibited by VHH). The biodistribution profile of VHH-Zag was determined with technetium 99 m (99mTc) and gallium 67 (67Ga)- radiolabelling. The prolonged circulation time with both radionuclides lead to a reduction of the 99mTc-VHH-Zag in kidneys and an increase of the presence of the fusion anti-TNFα VHH in blood and other organs, e.g. liver, intestine, muscle and lungs. The biodistribution profile of VHH-ProtH was evaluated with 99mTc, presenting a similar organ distribution that the observed for the nanobody alone. Accordingly, 99mTc-VHH-ProtH is retained in kidneys and showed a trend to accumulate within highly perfused organs like and intestine. Though, Zag and ProtH unmodified ABDs preserved the albumin-binding ability and thermal stability of the fusions with the recombinant antibody, these domains present very different amino acid sequences and unit organization. Whereas, Zag ABD presents one domain with 52 aa, ProtH ABD possess three C repeats (C1C2C3) that were tested in ELISA assays to evaluate the binding of each unit alone (C1, C2 and C3) or several combinations of these repeats (C1C2, C2C3 and C1C2C3), to human serum albumin. The results obtained showed that C1 repeat is a key unit for the albumin-binding, presenting the highest HSA binding with similar values that those observed with the three repeats. The predicted in silico of the three-dimensional structure of ProtH showed an α-helical conformation. Nuclear magnetic resonance (NMR) assignments show that Zag domain presents a three-α-helix threedimensional structure. Circular dichroism (CD) measurements confirmed the α-helical conformation of these motifs and also indicate that the conformation of both ABDs is maintained in the presence of HSA. In summary, the results presented on this Thesis strongly demonstrate that Zag and ProtH ABDs are promising strategies to increase the half-life of therapeutic proteins. Both ABDs will be certainly an alternative to the recent most used PEGylation or N-glycosilation approaches to improve therapeutic applications of recombinant proteins. Furthermore, Zag and ProtH can be engineered and be used on therapeutic applications as protein scaffolds.
Nos últimos anos, os formatos de anticorpos recombinantes e as proteínas terapêuticas têm sido desenvolvidos e utilizados para diversas aplicações terapêuticas, como por exemplo, para o tratamento de cancro e doenças inflamatórias, entre outras. Enquanto que os anticorpos no seu formato natural, ou imunoglobulinas, possuem um tempo de semi-vida excepcionalmente longo, os pequenos derivados de anticorpos e as proteínas terapêuticas são, geralmente, rapidamente eliminadas da circulação sanguínea. Para aplicações terapêuticas esta característica faz com que, frequentemente, seja necessário recorrer-se a uma administração frequente e a infusões repetidas com uma aplicação intravenosa ou subcutânea, utilizando uma adsorção lenta destes medicamentos biológicos na corrente sanguínea. Estas limitações, inúmeras vezes relacionadas com o reduzido tamanho destas moléculas, têm resultado no desenvolvimento e implementação de diversas estratégias de extenção do tempo de semi-vida, para prolongar a sua presença na circulação sanguínea. Desta forma, é possível melhorar o seu modo de administração e as suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, sem afectar a sua eficácia terapêutica. Actualmente, algumas das estratégias mais utilizadas pela indústria farmacêutica para aumentar o tempo de circulação deste tipo de moléculas terapêuticas, como a PEGilação e a glicosilação, apresentam várias desvantagens. Entre as mesmas encontram-se os elevados custos na produção, o facto de o processo de conjugação nem sempre produzir moléculas com iguais propriedades terapêuticas e de não serem métodos que permitam uma reprodutividade das características da molécula terapêutica, na sua produção. Para evitar estes problemas, existe uma necessidade de desenvolvimento de metodologias alternativas para o mesmo fim. Deste modo, neste projecto científico desenvolvemos novas estratégias para melhorar o tempo de semi-vida de proteínas terapêuticas, utilizando dois domínios de ligação à albumina, provenientes de proteínas da superfície celular de estreptococos (proteína ZAG e a proteína H). A proteína ZAG é uma proteína da superfície membranar de Streptococcus zooepidemicus, que apresenta um domínío de ligação à albumina (Zag) constituído por 52 aminoácidos. Esta proteína também possuí uma região de ligação às imunoglobulinas. Assim como a proteína ZAG, a proteína H, proveniente da superfície celular de Streptococcos pyogenes, também apresenta um domínio de ligação à albumina (ProtH), constituído por três unidades denominadas repetições C (C1C2C3) e uma região de ligação às imunoglobulinas. Pensa-se que estas proteínas possam ser factores de virulência bacterianos e que possam funcionar como mecanismo de escape das bactérias à vigilância do sistema imunitário, camuflando estes microorganismos com proteínas plasmáticas do hospedeiro. Uma vez que a albumina é das proteínas plasmáticas mais abundantes e apresenta um tempo de semi-vida muito elevado (~19 dias em humanos), o objectivo deste trabalho científico foi utilizar a capacidade natural de ligação à albumina destes domínios para, em fusão com um proteína terapêutica, melhorar o desempenho farmacocinético destas moléculas, aumentando assim o seu tempo de semi-vida em circulação. Deste modo, os domínios de ligação à albumina (ABDs, do inglês albumin-binding domains) Zag e ProtH foram testados utilizando, como prova-do-conceito, um anticorpo recombinante (VHH, designado também por nanobody) desenvolvido pela empresa de biotecnologia belga Ablynx contra o TNFα (factor de necrose tumoral alfa), para o tratamento da artrite reumatóide. Este nanobody foi desenvolvido para bloquear a interacção entre o TNFα e o seu receptor, prevenindo assim o desencadeamento da resposta inflamatória responsável pela formação das junções artritícas, nos doentes com artrite reumatóide. Este tipo de moléculas têm sido sido extensivamente estudadas ao longo dos últimos anos para o tratamento da artrite reumatóide e encontram-se em ensaios clínicos de fase II, com o nome de ATN-103 (actualmente Ozoralizumab). Os resultados obtidos mostraram que ambos os ABDs sozinhos ou em fusão com o VHH podem ser estavelmente produzidos em bactérias, preservando as suas propriedades naturais de ligação à albumina, com uma ligação às albuminas humana, de rato e de ratinho na ordem do nanomolar e apresentando também elevadas estabilidades térmica e no soro humano e de ratinho. Adicionalmente, a fusão destes domínios com o VHH não afectou a ligação ao TNFα nem a eficácia terapêutica do nanobody. A fusão dos domínios Zag e ProtH com a molécula terapêutica aumentaram eficazmente o tempo de semi-vida da mesma. Comparando com o anticorpo recombinante não-modificado (tempo de semi-vida terminal de 47 min), o VHHZag (tempo de semi-vida terminal de ~31 h) e o VHH-ProtH (tempo de semi-vida terminal de ~21 h) apresentaram aumentos de 39 e de 26 vezes, respectivamente, no tempo de circulação plasmática em murganhos. Após injecção, observou-se a presença no sangue de ratinho até às 72 h para o VHH-Zag e até às 48 h para o VHH-ProtH, comparando com o curto tempo apresentado para o VHH de apenas 2 h. O perfil de biodistribuição do VHH-Zag foi avaliado utilizando a marcação com os radioisótopos tecnécio 99 m (99mTc) e gálio 67 (67Ga). Nos estudos feitos com os dois radioisótopos, verificou-se que a extensão do tempo de circulação do VHH-Zag também influenciou o perfil de biodistribuição, conduzindo a uma redução da presença do anticorpo nos rins e um aumento da quantidade de proteína no sangue e nos orgãos mais irrigados, como o fígado, intestino, músculos e pulmões. O perfil de biodistribuição do VHH-ProtH foi determinado, usando apenas a marcação com o radioisótopo 99mTc. Deste modo, o 99mTc- VHH-ProtH mostrou um perfil de biodistribuição diferente do 99mTc-VHH-Zag, mas semelhante ao do 99mTc-VHH, ou seja, com uma retenção mais acentuada nos rins e uma menor presença no sangue. O 99mTc-VHH-ProtH também mostrou uma tendência para se acumular em orgão altamente perfundidos, como o intestino. Contudo, embora o 99mTc-VHHZag e o 99mTc-VHH-ProtH apresentem um perfil de biodistribuição diferente, ambos revelaram um elevado tempo de semi-vida, comparando com o nanobody não-modificado. Deste modo, o nosso objectivo de desenvolver estes domínios como estratégias para aumentar o tempo de semi-vida de proteínas foi alcançado. Após se determinar que os ABDs Zag e ProtH em fusão com o anticorpo mantinham a sua capacidade de ligação à albumina, fomos investigar se estes domínios não-modificados mantinham as mesmas propriedades. Para atingir este objectivo, as proteínas Zag e ProtH foram clonadas num vector de expressão bacteriano, expressas em E. coli e, posteriormente purificadas. Seguidamente, verificamos que os domínios de ligação à albumina Zag e ProtH não-modificados preservam as propriedades de ligação às albuminas humana, de rato e de ratinho observadas anteriormente, assim como também mantêm a estabilidade térmica observada quando se encontram em fusão com o VHH. Estas proteínas possuem uma sequência de aminoácidos e organização de domínios muito diferentes. Enquanto que o domínio Zag é composto por uma única unidade de 52 aminoácidos, o domínio ProtH é constituído por três unidades, denominadas de sequências repetidas C ou repetições C (C1C2C3). Estas unidades apresentam, entre si uma elevada homologia entre as suas sequências aminoacídicas. Para avaliar a ligação que cada uma destas unidades à albumina, várias combinações destes domínios (C1, C2, C3, C1C2, C2C3, C1C2C3) foram expressas em bactéria e purificadas. De todas as combinações, a unidade C1 tem uma elevada ligação à albumina humana semelhante à ligação observada com os três domínios juntos, mostrando assim que esta unidade apresenta um papel muito importante para a ligação à albumina de todo o domínio. De todas as repetições C, a C1 também é a que apresenta uma maior estabilidade térmica. A previsão in silico da estrutura tridimensional do ABD ProtH revelou uma possível conformação de alfa-hélix. Os resultados de resonância magnética nuclear (RMN) mostraram que o ABD Zag possui uma estrutura tridimensional de tri-α-hélix. Os dados de dicroismo circular confirmam os resultados referidos anteriormente e indicam que, em ambos os domínios, a ligação à albumina não altera a conformação de nenhuma destas proteínas, mantendo a sua conformação helical. Como perspectivas futuras, seria interessante determinar a estrutura tridimensional do domínio ProtH e investigar por RMN ou cristalografia de raio-X as interacções entre a albumina e estas proteínas. Assim será possível determinar o local de ligação à albumina de cada um destes domínios. Em conclusão, estes resultados demonstram que os domínios de ligação à albumina Zag e ProtH podem ser utilizados como estratégias promissoras, para o aumento do tempo de semivida de proteínas terapêuticas, como alteranativa às metodologias mais utilizadas actualmente pela indústria farmacêutica. Outra potencial aplicação para estas proteínas será a seu desenvolvimento como scaffolds terapêuticos para o tratamento de inúmeras doenças, como por exemplo, a artrite reumatóide.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Biotecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/12093
Designação: Doutoramento em Farmácia
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