Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/12106
Título: Modulation of Acute Myeloide Leukaemis (AML) metabolism by the vascular Endothelial Growth Factor (VEGF): in vitro study
Autor: Nunes, Carolina Martins Resende Alves, 1991-
Orientador: Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-
Serpa, Jacinta
Palavras-chave: Leucemia aguda mieloblástica
Metabolismo do lactato
Expressão génica
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Several studies have highlighted cancer metabolism as a suitable target to develop new therapies. This thesis aimed at determining the role of lactate metabolism in AML, both VEGF dependent and independent, by developing an in vitro study (pro-myelocytic-HL60 and erithroblastic-HEL). We observed that HL60 and HEL have different metabolic profiles when exposed to lactate and/or VEGF. NMR analysis showed that HL60 uses lactate to synthetize acetate, amino acids and malate and upon VEGF stimulation nucleotides are detected though not originated from lactate or glucose. Concordantly, VEGF exposure increases the expression of MCT1 in HL60 cells. HEL cells’ metabolic profile is not altered by VEGF stimulation and lactate is mainly converted into malate and proline. However, VEGF decreases MCT1 and MCT4 levels in HEL. In both cell lines, LDHA and LDHB expression levels are equivalent between conditions. Concerning VEGF receptors, in HL60 VEGF increases and lactate decreases the levels of KDR, expressing more FLT1. HEL cells barely express KDR and all the stimulations tested increase the expression of FLT1. Cell cycle analysis showed that VEGF and lactate increase proliferation of respectively HL60 and HEL cells. The percentage of dead cells in the same conditions was higher, assenting the concomitant media consumption. In order to validate our results, we verified that the majority of BM samples express higher levels of MCT1 than MCT4. By immunohistochemistry, MCT1 is expressed in aberrant and large cells whereas MCT4 is expressed in normal mature and progenitor cells. MCT1 positive cells are preferentially localised in paratrabecular regions, the VEGF rich niches. Our study showed VEGF regulates lactate metabolism and proliferation in monocytic AML cells. In human samples, higher levels of MCT1 are expressed at diagnosis and relapse, being MCT1 expressed in cells morphologically aberrant. Taking together out results indicate MCT1 as a suitable therapeutic target in AML.
Cancro define um vasto grupo de neoplasias malignas que resultam de várias alterações dos mecanismos fisiológicos que regulam os vários processos celulares. O processo de carcinogénese conduz à aquisição de uma série de características onde se incluem o aumento da taxa de proliferação, sobrevivência e resistência à morte celular. A causa final da morte da maioria dos doentes com cancro é o desenvolvimento de metástases [1], que se formam a partir da capacidade que as células cancerígenas têm de se separar do tumor primário, migrar, invadir e colonizar outros órgãos. O conhecimento da biologia do cancro tem vindo a crescer exponencialmente nas últimas duas décadas. A carcinogénese é um processo de várias etapas que reflecte alterações genéticas que levam à transformação progressiva de células normais em células malignas [2]. Hanahan e Weinberg [3], propõem que, durante o processo de carcinogénese, as células têm de adquirir seis características biológicas principais: sustentar a capacidade proliferativa; evadir-se aos sinais de supressores de crescimento; resistir à morte celular; adquirir uma capacidade replicativa infinita; induzir angiogénese, e desencadear o processo de invasão e metastização. Mais recentemente, os mesmos autores revelaram mais duas novas características: a capacidade de escapar ao controlo do sistema imunitário, e a capacidade de adaptação do metabolismo energético. A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença clonal geneticamente heterogénea caracterizada pela acumulação de alterações genéticas somáticas em células progenitoras hematopoiéticas que levam à alteração dos mecanismos normais de auto-renovação, proliferação e diferenciação destas células [4]. Estas alterações levam a uma perda da função hematopoiética normal que pode resultar em insuficiência da função dos glóbulos brancos e vermelhos, bem como as plaquetas e que, quando não tratada, geralmente leva à morte do doente em semanas ou meses após do seu diagnóstico [5, 6]. Hanahan e Weinberg [3] identificaram a reprogramação do metabolismo energético como uma das marcas biológicas emergentes das células cancerígenas. A proliferação de células cancerígenas apresenta exigências metabólicas diferentes em comparação com a maioria das células diferenciadas normais [7]. De forma a responder às necessidades de uma elevada taxa de proliferação, as células cancerígenas consomem mais nutrientes para suprir as vias de síntese de macromoléculas. As vias metabólicas devem assim ser reprogramadas de forma a equilibrar os processos biossintéticos com a produção de ATP necessária para suportar o crescimento e sobrevivência celular [8]. Em alguns tumores, a taxa de glicólise é normalmente mais elevada do que nos tecidos normais, principalmente para sustentar a replicação do DNA através da via das fosfatos de pentose (PPP), em detrimento da obtenção do máximo de ATP a partir da glucose [9]. A manutenção desta taxa de glicólise requer elevadas quantidades de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NAD+), que é eficientemente produzido na conversão de piruvato em lactato, promovendo a auto-suficiência da glicólise que passa a depender apenas da capacidade celular de captação de glucose [10]. Os elevados níveis de lactato resultante da glicólise têm sido correlacionados com o aumento de metástases, reincidência do tumor e mau prognóstico. O metabolismo (anabolismo e catabolismo) do lactato assenta da acção de enzimas desidrogenases de lactato (LDHs) e dos transportadores de monocarboxilados (MCTs). As LDHs compreendem um grupo de cinco isoenzimas tetraméricas que resultam da combinação de duas subunidades A e B. De acordo com a sua composição estas enzimas podem catalisar a conversão de piruvato em lactato ou o contrário com interconversão de NADH e NAD+ [11, 12]. Em muitos tumores, principalmente nos altamente glicolíticos, encontram-se níveis mais elevados de expressão de LDHA do que em tecidos normais, o que está relacionado com o mau prognóstico da doença [13, 14]. A LDHB esta ligada ao crescimento do tumor em cancro de mama de células basais e está presente em tumores com potencial metastático mais elevado [15, 16]. Os MCTs constituem uma família de 14 transportadores codificados pela família de genes de transportadores de monocarboxilados (SLC16) evolutivamente conservada, e têm como função transportar uma única molécula carboxilada através da membrana. Até hoje apenas quatro dos MCTs (MCT1-4) foram caracterizados como facilitadores de transporte de piruvato e lactato sendo cruciais para a homeostasia do lactato [17, 18]. No contexto do cancro, o MCT1 (importação de lactato) e o MCT4 (exportação de lactato) são os dois principais MCTs encontrados em células tumorais sendo que elevados níveis destes transportadores estão relacionados com um mau prognóstico. Um tumor apresenta um gradiente de O2 dependente da distância a que se encontra dos vasos sanguíneos funcionais. As células tumorais mais próximas de um vaso sanguíneo têm mais oxigénio disponível enquanto as mais afastadas têm menos, estando portanto em hipoxia. Estas últimas células vão ter níveis mais elevados do factor indutível pela hipoxia (HIF-1) que vai leva ao aumento do consumo de glucose e, consequentemente, ao aumento da sua conversão em piruvato que é então convertido em lactato por LDHA. Este lactato produzido pelas células em hipoxia é exportado pelo MCT4. Sonveaux et al (2008) [19] descreveu que as células tumorais aeróbicas, mais próximas dos vasos, expressam mais MCT1 e importam o lactato que é usado como fonte de carbono e energia através da acção da LDHB. Estas células consomem então lactato em detrimento da glucose que fica então disponível para ser consumida pelas células tumorais em hipoxia [19, 20]. Para além do seu papel na angiogénese, o factor de crescimento VEGF também tem sido descrito como um factor de sobrevivência para as células cancerígenas, incluindo LMA [21]. A desregulação da produção de VEGF tem um impacto significativo sobre o desenvolvimento de leucemia e constitui um passo importante para a progressão em LMA [22]. Está descrito que, por via parácrina, as células de LMA aumentam a produção de VEGF o que leva a que as células endoteliais presentes na medula óssea a segregar vários factores de crescimento e citoquinas que estimulam o crescimento de células LMA [23, 24]. No presente trabalho pretende-se determinar o papel do metabolismo do lactato, dependente ou não de um estímulo de VEGF, em LMA. Para isso foram usadas duas linhagens de LMA diferentes, uma pro-mieloblástica (HL60) e outra eritroblástica (HEL) e amostras de doentes com LMA. Os resultados obtidos por ressonância magnética nuclear (NMR) demonstram que em HL60 os carbonos do lactato são incorporados na síntese de acetato, aminoácidos e malato independentemente da presença de VEGF e que quando este está presente a glucose não é detectada nos extractos celulares. Nas HEL a estimulação com VEGF não produz qualquer modificação visível no seu perfil metabólico, sendo que o lactato é convertido maioritariamente em malato e prolina. Em condições normais, as HL60 importa mais 13C-lactato que as células HEL, quando estimulamos as células com VEGF os níveis de incorporação de lactato pelas células HL60 descem para níveis semelhantes às HEL controlo. Brito (2011) [25] observou que as células HL60 quando estimuladas com VEGF expressam mais MCT1 enquanto a estimulação com lactato e/ou VEGF nas HEL diminui a expressão de MCT1. A expressão de MCT4 em ambas as linhas só parece ser afectada pela presença de lactato e VEGF. A expressão de LDHA e B em células HL60 e HEL não parece ser afectada pela estimulação com lactato e/ou VEGF. Relativamente à expressão dos receptores de VEGF (FLT1 e KDR) em células HL60 observa-se que a estimulação com lactato e VEGF leva a um aumento de expressão de FLT1 e que em células HEL todas as estimulações levam a um aumento da expressão de FLT1. Em ambas as linhas celulares temos uma aparente deslocalização do VEGF para o núcleo quando estimuladas com lactato e VEGF sendo que nas células HEL esta observação é feita também no controlo e na estimulação com VEGF. A expressão do KDR em células HL60 parece aumentar quando as células são tratadas com VEGF e diminuir quando expostas a lactato com e sem VEGF. Através da análise do ciclo celular por FACS vemos que as células HL60 apresentam um menor tempo acumulado de duração do ciclo celular quando são estimuladas com VEGF, enquanto nas células HEL o mesmo acontece na presença de lactato. O ensaio de morte celular vem de encontro a estas observações uma vez que temos um aumento das células necróticas quando as células são expostas a VEGF. Em simultâneo explorámos o papel de FOXM1 na regulação da expressão de MCT1, com base trabalho realizados pelo nosso grupo em outros modelos de cancro. Contudo, neste modelo in vitro de LMA, o FOXM1 não parece ser um activador da expressão de MCT1. Em amostras de medula óssea de doentes com LMA foi possível verificar que a maioria dos doentes expressam níveis mais elevados de MCT1 do que MCT4 ao nível do RNA. Doentes com recidiva da doença, apresentam um aumento da expressão relativa de MCT1. A análise por imuno-histoquímica revela que MCT1 e MCT4 são expressos em células diferentes, o MCT1 é expresso em células grandes e com morfologia aberrante (blastos leucémicos) e o MCT4 é expresso em células maduras de várias linhagens e células progenitoras normais. As células MCT1 positivas têm tendência para uma disposição para-trabecular (junto às trabéculas ósseas) enquanto as MCT4 positivas encontram-se difusamente distribuídas. O que está de acordo com a descrição dos nichos de blastos leucémicos na medula óssea que se encontram nas zonas ricas em VEGF próximas do osso [26]. Em conjunto, estes resultados demonstram que VEGF influencia a proliferação e o metabolismo de células de LMA de linhagem monocítica influenciando a expressão de intervenientes no metabolismo do lactato. O MCT1 é um elemento crucial no metabolismo de lactato e está expresso em células leucémicas de doentes com LMA. Assim, o MCT1 poderá constituir um novo alvo terapêutico em doentes com LMA.
URI: http://hdl.handle.net/10451/12106
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