Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/12364
Título: CFTR trafficking and membrane anchoring: the role of cAMP signalling
Autor: Lobo, Miguel Gonçalo de Oliveira Jones Ferrão
Orientador: Farinha, Carlos, 1973-
Palavras-chave: Bioquímica
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: A Fibrose Quística (FQ), a doença recessiva autossómica letal mais comum na população caucasiana, é caracterizada por uma grave disfunção da função pulmonar causada pela obstrução das vias respiratórias devido à acumulação de muco e consequentes infecções bacterianas. A FQ é causada por mutações no gene que codifica para uma glicoproteína com 1480 resíduos de aminoácidos, designada CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Esta proteína, presente na membrana apical de células epiteliais, actua como um canal de cloreto. Até à data, foram identificadas cerca de 2000 mutações possíveis causadoras da doença, sendo a mais comum a delecção de três nucleótidos que correspondem ao resíduo de feninalanina na posição 508 da proteína (F508del). Durante a sua síntese proteica, a proteína CFTR é inserida co-traducionalmente na membrana do retículo endoplasmático, onde adquire a sua conformação nativa, devido à acção de vários chaperones, e passa por um processo de glicosilação inicial. Daqui, é transportada para o Golgi onde os seus resíduos glicídicos são modificados, originando a sua forma madura. Posteriormente, é transportada em vesículas para a membrana plasmática (PM) onde exerce a sua função. Aqui, a proteína CFTR é endocitada sendo depois reciclada de volta para a PM ou enviada para degradação lisossomal. O equilíbrio entre estes processos é crucial para a quantidade de proteína presente na membrana. Na PM, a proteína CFTR pode estar ancorada a filamentos de actina, o que contribui para a sua estabilidade membranar. A proteína CFTR, através da sua região C-terminal, interage com várias proteínas com um domínio PDZ, nomeadamente a proteína adaptadora NHERF1 (Na+/H+-exchanger regulatory factor isoform 1), que por sua vez interage com proteínas do citoesqueleto, tal como a ezrina. Desta forma, o complexo CFTR-NHERF1-ezrina-actina contribui para a imobilização e ancoragem da proteína CFTR na PM, prevenindo a sua endocitose. Dessa forma, a ancoragem da CFTR na superfície celular é uma importante via a ser considerada em termos da intervenção terapêutica em doentes com FQ. Uma vez na PM, a proteína CFTR está envolvida na regulação do transporte transepitelial de iões e água. A abertura do canal CFTR é regulada pela fosforilação catalisada pela proteína cinase A (PKA) em resposta a um aumento local dos níveis de AMP cíclico (cAMP). A compartimentalização do cAMP depende da integridade do citoesqueleto e é essencial para um aumento da especificidade e eficiência da sinalização deste mensageiro secundário. Uma vez que a actividade da PKA é dependente dos níveis de cAMP, esta cinase tem sido reconhecida como a ligação entre a proteína CFTR e o cAMP. No entanto, a PKA não é o único sensor de cAMP que existe na célula; a proteína EPAC (exchange protein directly activated by cAMP) também actua como um efector do cAMP. A proteína EPAC funciona como um factor de troca de nucleótidos de guanina para a Rap, uma pequena GTPase (enzima que hidrolisa GTP) da família Ras. Esta GTPase está activa quando ligada a GTP e inactiva quando ligada a GDP. Assim, a proteína EPAC promove a activação deste interruptor molecular, já que leva à ligação de GTP. Em resposta ao aumento dos níveis de cAMP, a proteína EPAC transloca do citosol para a PM, onde pode activar a Rap. A interacção com a PM pode ser feita de uma forma dependente de ácido fosfatídico ou através da proteína do citoesqueleto ezrina. Esta informação sugere que a proteína EPAC pode co-localizar, ou até mesmo interactuar, com a proteína CFTR, e, possivelmente, regular a sua função ou estabilidade membranar. A proteína EPAC está envolvida em várias funções biológicas, principalmente devido às várias localizações sub-celulares que esta proteína pode ter e aos vários parceiros moleculares com que pode interagir. Nomeadamente, está envolvida na regulação da adesão célula-célula ou célula-matriz, organização do citoesqueleto ou polarização celular - processos que afectam a regulação da proteína CFTR, e que estão em geral alterados na FQ. Desta forma, o objectivo deste trabalho consistiu em caracterizar a interacção entre a proteína CFTR e a principal isoforma da proteína EPAC, a EPAC1, e avaliar o impacto deste sensor de cAMP na biogénese, tráfego e ancoragem da CFTR na PM. O primeiro passo do trabalho consistiu em avaliar se o composto 007-AM de facto actua como um análogo do cAMP específico para a EPAC (e não PKA). Este estudo, bem como outros posteriores, foi realizado em células CFBE (Cystic Fibrosis Bronchial Epithelial) de forma a melhor mimetizar os processos que ocorrem no epitélio brônquico de pacientes com FQ. Outras linhas celulares de epitélio respiratório também usadas foram as linhas Calu3 (de glândula submucosa) e A549 (alveolar). A análise por FRET mostrou que o sensor dos níveis de cAMP baseado na estrutura da EPAC sofre grande alteração da percentagem de FRET, o mesmo não se observando com o sensor da actividade da PKA – o que permitiu evidenciar a selectividade do 007-AM para a EPAC. A activação da proteína EPAC, em resultado do tratamento das células com 007-AM, promove a sua translocação para a PM, em células CFBE, de uma forma independente da proteína CFTR. Além disso, usando um sensor FRET da actividade da EPAC e um ensaio para a actividade da Rap1A (uma das isoformas da Rap), observou-se que células que expressam CFTR WT (wild-type) apresentaram um aumento de FRET na PM após tratamento com 007-AM, enquanto células que expressam CFTR F508del tendem a ter níveis mais elevados de Rap1A na forma activa. O tratamento com 007-AM promove também um aumento dos níveis de Rap1A activa em células que expressam CFTR WT mas não nas que expressam CFTR F508del. Adicionalmente, o tratamento com 007-AM promoveu a adesão celular em células que expressam CFTR WT mas não nas células que expressam CFTR F508del. Isto sugere que, em células que expressam CFTR com esta mutação, a via EPAC-Rap não consegue exercer a sua função e, de forma a ultrapassar esta limitação, a activação endógena da EPAC se encontra aumentada. Consequentemente, uma activação adicional não é detectada, dados os elevados níveis basais de activação. De seguida, a possível co-localização e interacção entre as proteínas CFTR e EPAC1 foi avaliada. Para isso, recorreu-se a microscopia confocal de fluorescência e a ensaios de co-imunoprecipitação. Observou-se que a EPAC1 co-localiza e interage com CFTR, quer na sua forma WT quer na sua forma mutada. Além disso, a activação da EPAC com 007-AM aumentou a interacção entre CFTR e EPAC1. No entanto, a activação da EPAC1 não afecta a razão de CFTR na forma madura e forma imatura (que permite avaliar a eficiência de processamento da CFTR). Estes dados sugerem que a EPAC não está envolvida na fase inicial da biogénese da CFTR (síntese, folding e processamento inicial). Observámos também que a depleção de NHERF1 (usando siRNA ou shRNA), mas não de ezrina, impediu a interacção entre a CFTR e a EPAC1 mas sem afectar a localização sub-celular da última. Isto sugere que a interacção entre estas duas proteínas é mediada pela proteína adaptadora NHERF1. Finalmente, recorreu-se a ensaios de endocitose e biotinilação para avaliar o efeito da EPAC1 na estabilidade da CFTR na PM. Observou-se que a activação da EPAC decresce a quantidade de CFTR que é internalizada ao longo do tempo. Além disso, o tratamento com 007-AM levou a um aumento dos níveis de CFTR na PM enquanto a depleção da EPAC1 usando siRNA diminuiu estes níveis. Adicionalmente, a sobreexpressão de EPAC parece também promover a estabilidade da CFTR. Estas abordagens sugerem que a EPAC1 está envolvida na regulação da estabilidade da CFTR na PM. Este efeito estabilizador permite também um aumento da quantidade de proteína CFTR F508del madura detectada após o tratamento simultâneo com o corrector de tráfego VX-809 e o agonista 007-AM. Apesar dos avanços recentes no campo da FQ, ainda existem vários aspectos do tráfego e activação da CFTR por elucidar e parceiros moleculares por identificar. Desta forma, os resultados deste trabalho permitiram identificar uma nova ligação entre a proteína CFTR e a sinalização por cAMP. Este trabalho constitui assim uma importante caracterização de um novo interactor da CFTR, a proteína EPAC1, que liga o cAMP à modulação da FQ, por mecanismos até à data não descritos.
CFTR, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, is a chloride channel expressed in the apical membrane of epithelial cells. The malfunction of this protein is responsible for cystic fibrosis, the most common lethal autosomal recessive disease in the Caucasian population. One of the numerous proteins that interacts with CFTR and also regulates the function of this channel through phosphorylation is protein kinase A (PKA). Because PKA activity is cAMP-dependent, this kinase has been recognized as the link between this second messenger and CFTR. However, PKA is not the only cAMP sensor within the cell. EPAC, an exchange protein directly activated by cAMP, is another cAMP effector, involved in a number of cellular functions such as the regulation of cell-to-cell and cell-matrix adhesion, cytoskeleton rearrangements and cell polarization, processes that affect CFTR regulation and are defective in CF. The aim of this work was to characterize the interaction between CFTR and the most predominant isoform of EPAC, EPAC1, and to evaluate the impact of this cAMP sensor on CFTR biogenesis, trafficking and plasma membrane (PM) anchoring. Using a multidisciplinary approach, our results show that EPAC1 and CFTR co-localize and co-immunoprecipitate in airway epithelial cells. The second messenger cAMP promotes EPAC1 translocation to the PM and its interaction with CFTR. The adaptor protein NHERF1, but not ezrin, mediates the interaction between EPAC1 and CFTR. Furthermore, EPAC activation does not affect CFTR total protein levels or CFTR processing efficiency but promotes CFTR stabilization at the PM. Additionally, the presence of the most common CFTR mutation, F508del, seems to affect EPAC activity and EPAC-mediated cell adhesion. Thus, this work provided an important characterization of a new CFTR interacting protein that links cAMP to cystic fibrosis modulation in a previously unreported mechanism.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/12364
Designação: Mestrado em Bioquímica
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
ulfc110308_tm_Miguel_Lobo.pdf3,47 MBAdobe PDFVer/Abrir


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.