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Título: Otimização do direcionamento para células tumorais de nanosistemas lipídicos para uso terapêutico
Autor: Holovanchuk, Denys
Orientador: Corvo, Maria Luísa Teixeira de Azevedo Rodrigues, 1960-
Marinho, Helena Susana Pappámikail da Costa, 1958-
Palavras-chave: Lipossomas
Polietilenoglicol
Ácido fólico
Antagonista G
Direccionamento activo
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Lipossomas de longo tempo de circulação têm surgido como opções muito promissoras de sistemas de entrega de fármacos a células cancerígenas. Estas partículas são revestidas por polietilenoglicol (PEG), cuja função pode ser alargada para além dos horizontes de melhoria da sua biodistribuição. A possibilidade de modificação funcional por ligação covalente nas suas extremidades levou ao aparecimento de estratégias de direccionamento activo, nomeadamente com pequenas moléculas como ácido fólico (AF), explorando a sobreexpressão dos receptores de folato em inúmeros tipos de tumores. Neste trabalho, a ligação do AF aos lipossomas previamente formados foi explorada como um método único e alternativo aos actualmente existentes na preparação deste tipo de partículas. Com este objectivo, AF foi activado com um grupo sulfidrilo e ligado covalentemente aos lipossomas contendo DSPE-PEG2000-maleimida. Este processo não alterou o tamanho nem a carga dos lipossomas e permitiu obter quantidades de AF (detectado após a ligação) até 34 % (mol AF/maleimida). Adicionalmente foram preparados lipossomas modificados com o péptido antagonista G para direccionar os lipossomas para as células do carcinoma de pulmão, aplicando o mesmo método de ligação e por um método alternativo em que o péptido ligado ao DSPE-PEG-maleimida é inserido em lipossomas previamente formados (método de pós-inserção), ambos com elevados rendimentos de ligação, em comparação ao ácido fólico (71 % e 43 % mol péptido/maleimida, respectivamente). Os lipossomas foram testados in vitro em diferentes linhas celulares tumorais. O direccionamento com AF foi testado em células HeLa e MCF7 (elevada expressão e sem expressão de receptores de folato, respectivamente). Por outro lado, o direccionamento com antagonista G foi testado em células H69 que sobreexpressam receptores de neuropéptidos. A internalização de lipossomas direccionados, marcados com fosfatidiletanolamina de ovo marcada com rodamina, foi observada por microscopia de fluorescência.
Drug delivery systems targeted to tumor cells are an ever-growing field in cancer research. One of the most successful strategies in this field consists of employing long circulating liposomes as drug carriers. The presence of poly-(ethylene glycol) (PEG) on their surface allows membrane stabilization, decreases protein-liposome interactions and allows surface modification with molecules that recognize cell-specific surface markers. One of the most commonly and successfully employed targeting molecules is folic acid, which binds with high affinity to folate receptors, overexpressed in a wide variety of tumors. The present study addressed the development of a simple, yet unique method of linking covalently a targeting molecule to the surface of pre-formed PEGylated liposomes. Herein, the protocol of grafting liposomes with folic acid after their preparation was studied and optimized. For this purpose, folic acid was activated with a sulfhydryl group and linked to liposomes, containing DSPE-PEG2000-maleimide. This process did not interfere with liposome size or ζ potential and it was possible to detect this vitamin up to 34 % (mol FA/maleimide) in liposomes after linkage. Additionally, liposomes targeted to the lung carcinoma cells with the peptide antagonist G were prepared by the same method and by the post-insertion method (where DSPE-PEG-peptide was inserted in the liposomal bilayer), both with high linkage efficiency (71 % and 43 % mol peptide/maleimide respectively). In order to assess the targeting ability of prepared liposomes, in vitro internalization studies were conducted with different cell lines. Folate receptor overexpressing and non-expressing cell lines HeLa and MCF7 were cultured in presence of FA targeted liposomes and neuropeptide receptor overexpressing cells, H69 (lung carcinoma) were cultured in presence of antagonist G targeted liposomes. The cellular uptake of fluorescently labeled liposomes (egg-phospatidylethanolamine-rhodamine) was assessed by fluorescence microscopy. However, no qualitative differences were observed in the internalization patterns for all cell lines.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/12376
Designação: Mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica)
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