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Título: Utilização de derivados de calixarenos no isolamento de proteínas e biocatálise em solventes orgânicos
Autor: Semedo, Magda Sofia Soares de Carvalho Cardoso Nobre
Orientador: Karmali, Amin
Serralheiro, Maria Luísa Mourato de Oliveira Marques
Palavras-chave: Química analítica
Teses de mestrado
Issue Date: 2007
Resumo: Neste trabalho foram utilizados ácidos carboxílicos derivados dep-tert-butilcalix[4,6,8]areno na extracção selectiva de duas proteínas: a mioglobina ea hemoglobina. Os três calixarenos apresentaram a capacidade de extrair as proteínas para a fase orgânica, com parâmetros de extracção superiores a 0,90.Estas proteínas demonstraram pseudoactividade de peroxidase na reacção deoxidação da seringaldazina na presença de peróxido de hidrogénio, quer em meio aquoso quer em meio orgânico usando o derivado ácido de p-tert-butilcalix[6]arenoem clorofórmio. A biocatálise destas duas proteínas foi investigada variando os seguintes parâmetros: pH, concentração da proteína e do substrato. A actividade específica máxima da mioglobina foi determinada em meios aquoso e orgânico obtendo-se os valores de 1,08 x 10-1 e 1,37 x 10-1 U. mg proteína-1 a pHinicial de 6,5, respectivamente. A hemoglobina apresentou em meio aquoso actividade específica máxima de 1,04 U. mg proteína-1 a pH 5,5 e em meio orgânico de 9,92 x 10-2 U. mg de proteína-1, a pH inicial de 7,5.Os parâmetros cinéticos em meio aquoso (Vmáx, Km, kcat e kcat/Km) foram determinados em função do pH, assim como os parâmetros cinéticos aparentes(V'máx, K'm, k'cat e k'cat/K'm) em meio orgânico. A estabilidade do complexo proteína-calixareno foi analisada para ambas as proteínas em função do pH inicial tendo-se obtido valores de t1/2 na gama de2 5 dias. Os complexos proteína-calixareno no meio orgânico foram recuperados para soluções aquosas frescas alcalinas, com valores de recuperação da pseudo actividade de peroxidase superiores a 100%.O derivado ácido de p-tert-butilcalix[6]areno foi utilizado na extracção da hemoglobina a partir de sangue humano obtendo-se um valor de 0,50 para o parâmetro de extracção. A proteína foi purificada a partir de sangue humano usando uma matriz cromatográfica de um polímero contendo unidades de p-tertbutilcalix[6]areno na forma ácida, com um rendimento final de pseudo actividade da hemoglobina de 34,42 % e um factor de purificação de 12. A análise electroforéticada preparação purificada da hemoglobina revelou uma banda de proteína com Mr de61 kDa em PAGE nativa que foi coincidente com a banda de pseudo actividade deperoxidase in situ.
Derivatives of p-tert-butilcalix[4,6,8]arene carboxylic acids were used for selective extraction of two proteins myoglobin and hemoglobin. All three calixarenes were found to extract these two proteins to organic phase, exhibiting extraction parameters higher than 0,90.These proteins revealed pseudoactivity of peroxidase which catalysed the oxidation of seryngaldazine in the presence of hydrogen peroxide both in aqueous medium and in presence of tbutil[6]CH2COOH in chloroform. The effect of pH, protein and substrate concentrations was investigated in biocatalysis by using myoglobin and hemoglobin. The highest specific activities of myoglobin were 1,08 x 10-1 and1,37 x 10-1 U. mg protein-1 both in aqueous and organic media, respectively at pH 6,5whereas hemoglobin presented specific activities of 1,04 U. mg protein-1 at pH 5,5 in aqueous medium and 9,92 x 10-2 U. mg protein-1, at initial pH 7,5 in organic medium. Kinetic parameters (Vmáx, Km, kcat and kcat/Km) were determined in aqueous media at different pH and apparent kinetic parameters (V'máx, K'm, k'cat and k'cat/K'm) were also obtained in organic medium. Furthermore, the stability of the protein-calixarene complexes was investigated for different initial pH values and t1/2 values were obtained in the range of 2 5 days. Protein-calixarene complexes in organic medium were recovered in alkaline fresh aqueous solutions with recovery of pseudo activity of per oxidase over 100 %.Subsequently, p-tert-butilcalix[6]arene acid derivative was used for the extraction of hemoglobin from human blood with an extraction parameter of 0,5. Achromatographic matrix of a polymer containing units of acid derivative p-tertbutilcalix[6]arene was used for purification of hemoglobin from human blood with a final recovery of pseudo activity of peroxidase of about 34 % and a purification factor of 12. The purified preparation of hemoglobin was apparently homogeneous on native PAGE running with an approximate Mr of 61 kDa which was coincident with in situ detection of pseudo activity of peroxidase.
Descrição: Tese de mestrado em Química Analítica Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2008
URI: http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000561373
http://hdl.handle.net/10451/1299
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