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Título: Factores de transcrição artificiais na identificação de genes celulares importantes na infecciosidade do HIV-1
Autor: Pinto, Joana Borges Soares Ataíde
Orientador: Gonçalves, João
Correia, Maria do Céu
Palavras-chave: Genética microbiana
HIV-1
Expressão genética
Teses de mestrado
Issue Date: 2009
Resumo: Apesar dos notáveis avanços observados no tratamento da infecção por HIV-1 não foi ainda alcançada a total eliminação do vírus do organismo humano. Existem já estirpes de HIV-1 resistentes à terapia anti-retroviral actual e, persistem ainda problemas inerentes à sua toxicidade, efeitos secundários e elevado custo. Perante o actual panorama, é de extrema importância a descoberta de potenciais novos alvos farmacológicos que possibilitem o desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Este trabalho teve como objectivo a identificação de novos genes celulares importantes para a infecciosidade do HIV-1, tendo em vista o desenvolvimento de novos tratamentos contra a infecção. Para tal, utilizaram-se 3 bibliotecas de factores de transcrição sintéticos com domínios de ligação ao DNA com motivos de zinc-fingers (TFZF), fundidos com o activador transcricional VP64. As bibliotecas foram usadas para transduzir células Jurkat, de forma a obter clones capazes de expressar os TFZF de forma estável. Estes clones foram infectados com HIV-1 NL4-3 para avaliar a sua resistência ao vírus. Neste primeiro screening, as células transduzidas com a biblioteca 5FG revelaram-se inviáveis, e não foi possível isolar clones da biblioteca 5FG/A. Foram seleccionados 13 clones da biblioteca 5FA, tendo-se verificado que, num deles a produção de vírus foi consideravelmente inferior à de células controlo (clone resistente), e nos restantes 12 foi consideravelmente superior. Foi confirmada a presença de um TFZF integrado no genoma de todos os clones, tendo este sido isolado e sequenciado. A análise das sequências resultantes revelou a presença do mesmo TFZF em todos os clones, capaz de reconhecer uma sequência específica de DNA. Utilizando ferramentas bioinformáticas, foi possível revelar os vários locais do genoma humano onde o TFZF se poderia ligar, tendo sido identificados 137 novos genes potencialmente envolvidos no ciclo replicativo viral. O trabalho aqui descrito constituiu uma primeira abordagem à identificação de genes celulares importantes no ciclo do HIV-1 através de uma nova metodologia, baseada na modulação da expressão génica usando factores de transcrição artificiais. Os resultados preliminares obtidos constituem uma base importante para estudos futuros, sendo mais um passo na tentativa de clarificar a complexa relação entre o HIV-1 e o seu hospedeiro.
Despite of the remarkable advances made to treat HIV-1 infection, the complete elimination of the virus from the human body has not yet been achieved. There are already HIV-1 strains resistant to the current anti-retroviral therapy. Also, problems due to its toxicity, side effects and high cost, still remain. Facing this scenario, it is highly important to find new potential drug targets that allow the development of effective therapies. The purpose of this work is to identify new cellular genes important to HIV-1 infectivity, with the finding of possible new treatments on the horizon. In order to do so, 3 libraries of artificial transcription factors with zinc-fingers DNA-binding motifs (TFZF), fused with transcriptional activator VP64, were used to transduce Jurkat cells, towards getting clones capable of stably express the TFZF. These clones were infected with HIV-1 NL4-3 to evaluate their resistance to the virus. In this first screening, cells transduced with 5FG library proved to be non-viable, and no 5FG/A library clones were able to be isolated. Thirteen clones from the 5FA library were selected. In one of them, viral production was considerably lower (resistant clone), in comparison with control. In the remaining 12, viral production was considerably higher. We confirmed the presence of a TFZF integrated in the genome of all the clones, and this TFZF was isolated and sequenced. The sequence analysis showed that the TFZF was similar between clones, and capable of recognizing a specific DNA sequence. Using bioinformatics tools, it was possible to reveal several genome target sites, and identify new 137 genes potentially involved in viral replication. The work here described is a first time approach on modulating gene expression with artificial transcription factors, in order to identify cellular genes important in HIV-1 cycle. These preliminary results may be an important ground to future studies, and one more step towards clarifying the complex relationship between the virus and its host.
Descrição: Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular Humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
URI: http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000573847
http://hdl.handle.net/10451/1507
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