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Title: Non-viral gene delivery to human mesenchymal stem cells using cationic liposomes
Authors: Mendes, Rui Daniel Martins Nunes
Advisor: Silva, Cláudia Alexandra Martins Lobato da
Rodrigues, Maria Gabriela
Keywords: Biologia celular
Células estaminais
Técnicas biológicas
Teses de mestrado
Issue Date: 2009
Abstract: Mesenchymal Stem Cells (MSC) hold a great promise for application in several therapies due to their unique biological characteristics. MSC can be easily isolated from bone marrow (BM) based on its adherence to plastic, and can be expanded in culture while maintaining the capacity to differentiate into mesoderm-lineage cell types. These cells have demonstrated immunosuppressive properties, allowing their escape from host allogeneic responses. Importantly, MSC secrete a large spectrum of bioactive molecules that provide a regenerative microenvironment for a variety of injured tissues. Despite being successfully used for the treatment of many diseases, it might be essential to enhance some of their features through gene delivery strategies to harness their full potential in cell or gene-based therapies. In this context, the main goal of this work was to develop an efficient and safe methodology to genetically-engineer mesenchymal stem cells, enhancing their therapeutic efficacy in Regenerative Medicine settings. To this end the delivery of plasmid DNA (pDNA) encoding the gene of a green fluorescent protein (pVAX-GFP) was optimized for BM MSC using Lipofectamine, a cationic liposomes-based reagent. Importantly, it was also established a Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method for quantification of pVAX-GFP copy numbers in lipofected MSC. The new RT-PCR method, which was considerably useful for transfection optimization, showed good reproducibility and high sensitivity, covering a wide linear range from 74 to 7.4×105 copies pDNA/cell. MSC demonstrated better transfection efficiencies when plated both at earlier passages and high cell densities (15,000-25,000 cell/cm2) with an L/D 1.25 ratio. The obtained values of transfection efficiency ranged from 1.6% to 28.3% and eGFP was expressed during seven days. As transfected MSC have shown high cell viabilities and cell recoveries while maintained their multipotency, this is an advantageous transfection strategy when it is desirable to efficiently express the therapeutic gene in a safe and transient way.
As características biológicas típicas das células estaminais do mesênquima (Mesenchymal Stem Cells MSC) têm despertado o interesse para a sua potencial aplicação em diversas terapias. As MSC podem ser isoladas da medula óssea e depois expandidas, mantendo a capacidade de diferenciação em células de linhagens mesodérmicas. Estas células demonstraram propriedades imunosupressivas, permitindo a evasão a respostas alogénicas no hospedeiro. As MSC excretam um vasto espectro de moléculas bioactivas, fornecendo um microambiente regenerativo em diversos tecidos lesados. Apesar de terem sido utilizadas com sucesso no tratamento de várias doenças, torna-se necessário melhorar algumas das suas características através de estratégias de transfecção, aproveitando todo o seu potencial em terapias celulares e genéticas. Neste contexto, o objectivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia eficiente e segura para modificar as MSC geneticamente, melhorando a sua eficácia terapêutica em Medicina Regenerativa. Com este propósito foi optimizada a transfecção de DNA plasmídico (DNAp), contendo um gene que codifica para a proteína fluorescente verde (pVAX-GFP), em MSC da medula óssea usando Lipofectamina, um reagente à base de lipossomas catiónicos. Foi também estabelecido um método através de Real-Time PCR para a quantificação do número de cópias de pVAX-GFP dentro das células lipofectadas. O novo método desenvolvido por RT-PCR, demonstrou ser bastante útil na optimização da transfecção, apresentou boa reprodutibilidade e elevada sensibilidade, tendo sido detectada uma ampla gama de quantidades DNAp/célula (entre 74 e 7,4×105 cópias). As MSC apresentaram melhores eficiências de transfecção quando plaqueadas a passagens celulares baixas e densidades elevadas (15.000-25.000 céls./cm2), para uma razão L/D de 1,25. Os valores obtidos variaram de 1,6% a 28,3% e a expressão de GFP durou pelo menos sete dias. Uma vez que as MSC transfectadas apresentaram boas viabilidades e recuperação celulares, mantendo a sua capacidade de multipotência, esta estratégia de transfecção é vantajosa nos casos em que se pretende uma expressão eficiente, segura e transiente de um gene terapêutico.
Description: Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular Humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
URI: http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000576073
http://hdl.handle.net/10451/1513
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