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Title: Biochemical effects of protein glycation by methylglyoxal in Saccharomyces cerevisiae
Authors: Gomes, Ricardo Jorge dos Anjos, 1979-
Orientador: Cordeiro, Carlos, 1966-
Keywords: Bioquímica
Teses de doutoramento
Issue Date: 2007
Abstract: Protein glycation, the non-enzymatic and irreversible modification of amino groups by carbonyl compounds, is assuming an important role in the context of a widerange of human pathologies, including diabetes mellitus, age-related disorders andneurodegenerative diseases of amyloid type. Hence, there is a growing interest in thispost-translational modification and, ultimately, the quest for inhibitors of proteinglycation. However, despite extensive research, mainly by in vitro glycation studies withrelevant or model proteins, the role of glycation in pathological conditions is stillunknown. Therefore, cellular research models are required to investigate proteinglycation in vivo, the resulting biochemical effects and its role in human diseases.In the work presented in this thesis, a novel approach was developed toinvestigate protein glycation in vivo by methylglyoxal and its biochemical effects.Moreover, the role of glycation by methylglyoxal in protein amyloidogenesis was alsoinvestigated. It was found that protein glycation occurs in yeast and defined glycationphenotypes were identified. Although protein glycation was primarily associated withcomplex organisms and long-lived proteins, this post-translational modification alsoaffects short-lived organisms like yeast. A direct relationship between methylglyoxalformation rate and protein glycation was observed. A kinetic model of methylglyoxalmetabolism was developed to investigate the relative importance of the glyoxalasepathway, aldose reductase and methylglyoxal formation rate on the methylglyoxalsteady-state concentration and their relationship with protein glycation in vivo. It wasfound that the glyoxalase system and aldose reductase enzyme are equally important askey anti-glycation defenses in yeast. A higher methylglyoxal input leads to a directincrease in methylglyoxal concentration even in the presence of the glyoxalase systemand aldose reductase. In fact, challenging non-growing yeast cells with a high D-glucosemedium, consequently increasing methylglyoxal formation rate, causes methylglyoxalderivedprotein glycation even in the reference strain with all enzymatic defenses againstmethylglyoxal. Therefore, there is a subtle balance between methylglyoxal metabolismand the accumulation of MAGE-modified proteins, in which cells can prevent MAGEformation only until anti-glycation defenses are overcome.SummaryxviiiInterestingly, glycation in yeast appears to be a targeted process, whereby only afew proteins are modified. Protein identification, MAGE assignment and location weredetermined by mass spectrometry. The heat shock proteins Hsp71/72 and Hsp26 werefound to be glycated in vivo. Hsp26, a critical element in the unfolding stress response,was only detected in the soluble form upon glycation. This finding shows that Hsp26 ismost likely activated in glycation conditions, similarly to what happens in thermal stress.Three glycolytic enzymes were also glycated in yeast, namely phosphoglycerate mutase,aldolase and enolase, being the latter the main glycation target. This discovery prompteda deeper study of the biochemical implications of enolase glycation in vivo. Despite theobserved glycation-dependent activity loss of enolase, glycolysis and cell viabilityremained unchanged, hinting that yeast cells evolved to cope with high glycation levels.To investigate the effects of glycation on enolase structure and enzymatic activity, theprotein was purified from yeast cells under native and in vivo glycation conditions. Forthe first time, a protein was studied while enduring glycation in physiological conditions,allowing a direct comparison between in vivo and in vitro protein glycation. Significantdifferences were found between these distinct experimental conditions. In vivo glycationappears to be a specific process with only a few amino acid residues consistentlymodified with the same MAGE. Structural changes, evaluated by circular dichroismspectroscopy and thermal denaturation, showed that glycation mainly decreases α-helicalcontent and increase unordered structure while enolase structural rigidity increases. Invitro, a greater molecular heterogeneity was observed with different MAGE occurring atthe same molecular locations. α-Helical content also decreased, but in vitro glycationmarkedly increases ß-sheet content and structural rigidity was further enhanced. It wasalso observed that glycation causes enolase unfolding and dimer dissociation.Based on the identification of MAGE location by mass spectrometry, a molecularmodel for enolase inactivation upon glycation was developed. Glycation occurs at R414,a critical residue for dimer stability. Modification of R414 disrupts electrostaticinteractions with E20 on the other enolase chain that stabilize the enolase dimer, leadingto its dissociation and consequent formation of inactive monomers.The molecular location of MAGE in enolase suggests that the tri-dimensionalstructure may directly influence glycation reaction. The modified-arginine residues wereSummaryxixmainly found in an arginine-rich crevice located at the dimer interface, but solventaccessible. This arginine-rich cave could create a favourable environment formethylglyoxal-derived glycation reactions, sequestering free methylglyoxal that evadedfrom its catabolic routes. Hence, the high enolase reactivity towards methylglyoxalinducedprotein glycation could scavenge methylglyoxal, preventing changes in thebiochemical functionalities of other proteins. Upon glycation, enolase unfolds but cellsactivate the refolding chaperone pathway to counteract enolase misfolding and to limitthe harmful effects associated with extensive protein misfolding and aggregation.Yeast cells emerged as a living test tube to investigate the biochemical effects ofglycation on protein structure and function in vivo. So, taking advantage of this finding,the link between protein glycation and amyloid disorders, was investigated. Using animproved procedure for the extraction of amyloid fibrils from FAP patients, we providedthe first unequivocal evidence that methylglyoxal-derived advanced glycation endproductsare present in transthyretin amyloid deposits of FAP patients. Thus, we studiedthe effect of protein glycation in transthyretin amyloid fibril formation in yeast. For thispurpose, TTR variants with different amyloidogenic potentials (TTR-wt, TTR-L55P andTTRd-D) were expressed in Saccharomyces cerevisiae and amyloid deposits weredetected by fluorescence microscopy. It was observed that TTR is glycated when yeastcells are exposed to glycation conditions. Furthermore, the formation of transthyretinamyloidaggregates in cells expressing the amyloidogenic TTR-L55P variant is induced.These results provide the first direct evidence that glycation causes protein aggregation invivo in the context of human amyloid disorders.The presented results and conclusions are of great value not only to increase ourknowledge about protein glycation and its biochemical effects in vivo, but also to assign aclear role of this non-enzymatic process in the development of amyloid disorders. In thiscontext, yeast cells will certainly be useful as a eukaryotic model to study these processesat a cellular level. This is of vital importance in the design of novel or improved therapeutic strategies to inhibit protein glycation and counteract its harmful effects.
A glicação de proteínas é uma modificação pos-traducional, tendo como consequência a modificação irreversível de grupos amina por compostos contendo grupos carbonilo. Esta modificação tem sido implicada em diversas patologias humanas, tais como diabetes mellitus, doenças relacionadas com o envelhecimento e doenças neurodegenerativas do tipo amilóide. Neste contexto, a glicação de proteínas tem sido alvo de interesse na comunidade científica, com o objectivo final de desenvolver estratégias para inibir esta modificação pos-traducional. No entanto, apesar de intensivamente investigada in vitro com proteínas modelo ou clinicamente relevantes, o papel da glicação de proteínas no desenvolvimento de diversas condições patológicas não é ainda conhecido. Assim, é de extrema importância desenvolver modelos celulares para investigar a glicação de proteínas in vivo, os seus efeitos bioquímicos e finalmente a suaimportância nas diversas doenças humanas em que está envolvida.Neste trabalho, foi desenvolvida uma nova abordagem para investigar a glicaçãoin vivo pelo metilglioxal e os seus efeitos bioquímicos. Para além disso, foi tambéminvestigado o papel da glicação de proteínas pelo metilglioxal na formação de fibrasamilóides derivadas de uma proteína amiloidogénica. Observou-se a acumulação deproteínas glicadas pelo metilglioxal na levedura Saccharomyces cerevisiae, comdiferentes fenótipos de glicação. Apesar da glicação de proteínas ter sido associada aorganismos complexos e proteínas com baixo turnover, esta modificação pos-traducionaltambém afecta microrganismos como a levedura. Foi observado que existe uma relaçãodirecta entre a velocidade de formação de metilglioxal e a ocorrência de glicação. Ummodelo cinético do metabolismo do metilglioxal em S. cerevisiae foi construído parainvestigar a importância da via dos glioxalases, do aldose reductase e da velocidade deformação de metilglioxal na concentração em estado estacionário deste α-oxoaldeído.Com esta análise, verificou-se que o sistema dos glioxalases e o aldose reductase sãoigualmente importantes como defesas anti-glicação pelo metilglioxal. Observou-setambém que existe uma relação directa entre a velocidade de formação de metilglioxal e asua concentração em estado estacionário, mesmo na presença do sistema dos glioxalasesResumoxxiie do aldose reductase. De facto, um aumento da formação de metilglioxal, através daexposição de células a uma concentração elevada de D-glucose, provoca a glicação deproteínas pelo metilglioxal na estirpe de referência que apresenta todas as defesasenzimáticas contra o metilglioxal. Em condições fisiológicas, as células previnem aacumulação de proteínas modificadas pelo metilglioxal, mas só até as suas defesas seremultrapassadas.Na levedura S. cerevisiae, a glicação é um processo específico, onde apenasalgumas proteínas são modificadas. Estas proteínas foram identificadas porespectrometria de massa, assim como a natureza e localização dos produtos avançados deglicação derivados do metilglioxal (MAGE, Methylglyoxal Advanced Glycation Endproducts).As proteínas de choque térmico Hsp71/72 e Hsp26 foram identificados eapresentam modificações pos-traducionais derivadas da glicação pelo metilglioxal. AHsp26, um elemento crítico na resposta celular a condições de stress de unfolding, foiapenas detectada na forma solúvel após glicação. Esta observação indicia que a Hsp26 éactivada em condições de glicação, tal como se verifica em condições de stress térmico.Para além destas proteínas, três enzimas glicolíticos estão também glicados in vivo: ofosfoglicerato mutase, o aldose e o enolase, sendo este último o principal alvo deglicação. Um estudo detalhado das implicações bioquímicas da glicação in vivo doenolase foi realizado. Apesar de ter sido detectada uma diminuição da actividade desteenzima devido à glicação, a via glicolítica e a viabilidade celular permaneceraminalteradas, sugerindo que a levedura evoluiu de forma suportar elevados níveis deglicação. Para averiguar o efeito da glicação na estrutura e actividade enzimática doenolase, esta proteína foi purificada em condições nativas e em condições de glicação.Pela primeira vez, os efeitos da glicação in vivo na estrutura e função de uma proteína,foram investigados. Para além disso, este estudo permitiu efectuar uma comparaçãodirecta entre a glicação de proteínas in vivo e in vitro, tendo sido encontradas diferençassignificativas. In vivo, a glicação aparenta ser um processo específico, em que apenasalguns resíduos de aminoácidos são consistentemente modificados pelo mesmo MAGE.Nestas condições, a glicação induz alterações estruturais, observadas por dicroismocircular, com uma diminuição do conteúdo em hélice α e um aumento da estruturadesordenada e da rigidez estrutural. In vitro, foi observado uma elevada heterogeneidadeResumoxxiiimolecular, com o mesmo resíduo de aminoácido modificado por diferentes MAGE emdiferentes moléculas de proteína. Foi também detectada uma diminuição do conteúdo emhélice α, mas a glicação in vitro induz um aumento significativo de folha ß. Em ambas ascondições experimentais, a glicação causa a desnaturação do enolase, com a consequentedissociação do dímero, a forma activa do enzima.Com base na identificação da localização molecular dos MAGE porespectrometria de massa, foi proposto um modelo para a inactivação do enolase pelaglicação. Esta modificação pos-traducional ocorre em R414, essencial para a estabilidadeda forma dimérica. A formação de uma hidroimidazolona neste resíduo de argininadestrói as interacções electrostáticas com E20 da outra cadeia que estabilizam o dímero,levando à sua dissociação e consequente formação de monómeros inactivos.A localização molecular dos MAGE no enolase sugere que a estruturatridimensional da proteína influencia as reacções de glicação. As modificações ocorremmaioritariamente numa cavidade rica em resíduos de arginina localizada na interface dodímero. Este local pode criar um ambiente favorável a reacções de glicação pelometilglioxal, eliminando assim o metilglioxal não catabolisado pelos sistemasenzimáticos. Assim, a elevada reactividade do enolase para reacções de glicaçãoderivadas do metilglioxal pode diminuir a concentração intracelular deste α-oxoaldeído,prevenindo assim a alteração da função de outras proteínas celulares. Após glicação, oenolase sofre alterações estruturais resultando na desnaturação da proteína e a célulaactiva a via de refolding para neutralizar os efeitos nocivos associados a processos demisfolding proteico e agregação.Os estudos apresentados nesta tese revelaram que a levedura S. cerevisiaeconstitui um excelente modelo para investigar in vivo os efeitos bioquímicos da glicaçãona estrutura e função de proteínas. Assim, o papel da glicação de proteínas em doençasamilóides foi estudado na levedura S. cerevisiae como modelo celular. Utilizando ummétodo aperfeiçoado de extracção de fibras amilóides de pacientes com polineuropatiaamiloidótica familiar (FAP, Familial Amyloidotic Polyneuropathy), foi detectadainequivocamente a presença da argipirimidina (um produto avançado de glicaçãoderivado do metilglioxal) nos depósitos amilóides de transtirretina (TTR). Estaobservação indica que a glicação de proteínas deverá estar envolvida nesta doençaResumoxxivamilóide. Para investigar o papel da glicação na transtirretina e consequente formação defibras amilóides in vivo, variantes da TTR com diferentes potenciais amilóidogénicos(TTR-wt, TTR-L55P and TTRd-D) foram expressos em S. cerevisiae e os depósitosamilóides foram detectados por microscopia de fluorescência. Foi observada glicação invivo da TTR quando as células foram expostas a condições favoráveis à ocorrência desteprocesso. Nestas condições experimentais, foi observada uma indução da formação dedepósitos amilóides derivados da variante amiloidogénica TTR-L55P. Esta observaçãoconstitui a primeira evidência experimental de que a glicação de proteínas induz aagregação e formação de fibras amilóides in vivo.No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese e as conclusões inerentessão bastante importantes não apenas para compreender os mecanismos envolvidos naglicação de proteínas e consequentes efeitos bioquímicos in vivo, mas também paraclarificar o papel deste processo não enzimático no desenvolvimento de diversaspatologias humanas, como as doenças do tipo amilóide. Neste contexto, a leveduraSaccharomyces cerevisiae constitui um excelente modelo para investigar estes processosa nível celular. Estes estudos são de vital importância para desenvolver novas abordagensterapêuticas para inibir a glicação de proteínas e minimizar os seus efeitos prejudiciais.
Description: Tese de doutoramento em Bioquímica (Regulação Bioquímica), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008
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