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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/1531

Título: The role of the transcription factors Tbx3 and Tbx2 in heart development in zebrafish (Danio rerio) and mouse (Mus musculus) embryos
Outros títulos: O papel dos factores de transcrição Tbx3 e Tbx2 no desenvolvimento embrionário do coração em embriões do peixe zebra (Danio rerio) e no ratinho (Mus musculus)
Autor: Ribeiro, Inês, 1977-
Orientador: Izpisúa Belmonte, Juan Carlos, 1960-
Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-
Palavras-chave: Biologia do desenvolvimento
Teses de doutoramento
Issue Date: 2007
Resumo: O desenvolvimento embrionário do coração é um processo morfogenético complexo, ao qual se tem dado muita importância devido às repercursões que eventuais malformações têm na nossa vida quotidiana. Mutações em genes que controlam o desenvolvimento embrionário do coração estão na origem de doenças cardíacas congénitas, e anomalias do coração adulto representam a forma mais comum de morbilidade e mortalidade no mundo ocidental. O coração é o primeiro orgão a formar-se durante o desenvolvimento embrionário dos vertebrados em geral. É sobretudo o primeiro orgão funcional e a maior parte do seu desenvolvimento ocorre com o coração latendo. As células precursoras do coração são primeiro reconhecidas em dois campos cardíacos estabelecidos na mesoderme lateral esplâncnica, numa região posterior à mesoderme da cabeça. Estes dois grupos de precursores cardíacos, organizados num epitélio, migram em direcção à linha central do embrião onde se encontram formando o tubo cardíaco primitivo ou linear. Este tubo cardíaco é linear e é constituído por miocárdio (primário) que envolve o endocárdio no seu interior. É nesta altura que surgem os primeiros batimentos cardíacos, os quais são gerados por um centro sinalizador na região posterior do tubo cardíaco (região sino-aurícular). O tubo cardíaco passa então por vários passos de um processo de remodelação até se transformar num coração com quatro câmeras, dois ventrículos e duas aurículas. Primeiro, o tubo cardíaco primitivo inicia então o processo morfogenético denominado de looping , em que o tubo linear dobra sobre si próprio, colocando a região posterior (futuras aurículas) ao mesmo nível da região anterior (futuros ventrículos), e dorsal a esta. Ao mesmo tempo, a formação das câmeras e, como tal, a diferenciação do miocárdio primário, é iniciada com a consequência de que no final do looping as câmeras são visíveis. A formação das câmeras cardíacas ocorre em zonas específicas do tubo cardíaco, as curvaturas exteriores, que são definidas pela expressão diferential de genes marcadores de câmeras, como Anf. As curvaturas interiores do tubo cardíaco vão constituir o canal atrioventricular e o conus truncus. Assim, o miocárdio diferencia-se após compleção do looping especializando-se em câmera (ventrículo ou aurícula) ou não-câmera (canal atrioventricular, tracto de saída e entrada ). O miocárdio ao nível das câmeras cardíacas apresenta uma velocidade de condução, contractibilidade e actividade do retículo sarcoplasmático elevadas e umamaior taxa de proliferação celular. O miocárdio ao nível das curvaturas interiores mantémuma velocidade de condução, contractibilidade e actividade do retículos sarcoplasmáticoreduzidas, à semalhança do miocárdio primário do tubo cardíaco linear. Estas diferençasna velocidade de condução resultam num atraso na passagem do sinal do centrosinalizador, localizado nas aurículas, para o ventrículo dando origem a uma conduçãosincronizada, muito semelhante à adulta.Os factores de transcrição T-box (Tbx) são caracterizados por terem um domíniode ligação ao DNA muito conservado e denominado de T-box. Fora do domnínio T-box,os genes Tbx diferem muito sendo esta a base da classificação em diferentes subfamílias.Vários genes Tbx são expressos no tubo cardíaco durante desenvolvimento embrionário.Assim, Tbx5 é expresso ao longo de todo o tubo cardíaco linear, formando um gradienteem que a expressão é mais forte na parte posterior (região sino-aurícular), enquanto que oTbx20 é expresso ao longo de todo o tubo cardíaco linear. Os genes Tbx2 e Tbx3expressam-se no miocárdio ao nível das futuras válvulas cardíacas, ou seja, definindoespacialmente o miocárdio que não se especializa em câmera. Estes padrões de expressãoconstituiem um mapa de regionalização no coração linear, em que o miocárdio de câmeraé definido pela ausência de expressão de Tbx2 e Tbx3 e presença de Tbx5. A importânciadeste mapa de expressão no tubo cardíaco linear é comprovada pela existência de defeitoscardíacos nos síndromes humanos causados pela haploinsuficiência de TBX5 e TBX3. Noentanto, a tradução deste mapa de expressão de factores Tbx em comportamento celularainda não é totalmente compreendida.Como objectivo primordial, esta tese pretende esclarecer o papel que os factoresde transcrição Tbx2 e Tbx3 têm no desenvolvimento embrionário do coração. Estesfactores de expressão são expressos no coração desde a formação do tubo cardíaco lineare esta expressão é mantida até à fase adulta. Sendo o desenvolvimento embrionário docoração um processo longo e complexo, este estudo centrou-se na fase de remodelação dotubo cardíaco linear num coração embrionário com câmeras.Apesar de a estrutura básica do coração ser comum a todos os vertebrados, ospeixes possuem só duas câmeras cardíacas, um ventrículo e uma aurícula. Assim, certosxveventos do processo de remodelação do coração são melhor estudados em vertebradosinferiores. Nesta dissertação, o coração do peixe zebra (Danio rerio) foi utilizado comomodelo para o estudo do papel de Tbx2 e Tbx3 no desenvolvimento embrionário docoração. No Capítulo 2, são descritos dois factores de transcrição do peixe zebrahomólogos do Tbx2 e Tbx3, tbx2a e tbx3b. Os padrões de expressão de tbx2a e tbx3bsugerem uma semelhança com os homólogos do ratinho. A perda de função de tbx3bresultou num bloqueio no crescimento da barbatana peitoral e da vesícula ótica, bemcomo defeitos no coração, demonstrados pela presença de um inchaço no sacopericárdico. A perda de função de tbx2a também resultou em defeitos cardíacos, além detruncamento da cauda. Análise da perda de função dos dois genes demonstrou que tbx2a e tbx3b mantém funções não redundantes no desenvolvimento embrionário Os defeitos cardíacos causados pela ausência de função de tbx2a e tbx3b foramestudados em maior detalhe no Capítulo 3. Manutenção de expressão de marcadorescardíacos como bmp2b and bmp4 no coração na ausência de função de tbx2a e tbx3bdemonstra que a determinação das diferentes regiões do miocárdio parece ocorrernormalmente. No entanto, o desenrolar da remodelação cardíaca não ocorrenormalmente, demonstrado pela ausência de constrição entre o ventrículo e a aurícula, nochamado canal atrioventricular, e de looping em ambos os casos. Surpreendemente,sobre-expressão de Tbx2 ou Tbx3 do ratinho em embriões de peixe zebra causa tambémausência de looping, desta vez acompanhado de defeitos na formação das câmeras. Achave deste paradoxo parece estar no controlo da proliferação dos miocardiócitos porestes factores de transcrição, uma vez que quando existe sinal Tbx2 ou Tbx3 em todo omiocárdio (caso de sobre-expressão), os níveis de proliferação celular são reduzidos.Assim, a falta de sinal tbx2a ou tbx3b no futuro canal atrio-ventricular resultará numnível de proliferação celular semelhante ao nível que existe no miocárdio das futurascâmeras, impedindo a formação de uma constrição física no tubo cardíaco entre oventrículo e a aurícula, o que por sua vez dificulta o processo de looping .No Capítulo 4 são analizadas questões que surgiram do estudo do processo deremodelação do tubo cardíaco linear para um coração com as câmeras identificáveis nopeixe zebra. Assim, o processo de remodelação do coração do peixe zebra é descrito e asdiferenças entre o estabelecimento de expressão de marcadores cardíacos restringida aosxvidiferentes tipos de miocárdio são analizadas. Apesar de haver diferenças significativas, aexpressão de tbx2a parece ser controlada da mesma maneira no ratinho e no peixe zebra,pelo factor de sinalização Bmp2.O papel de Tbx3 no desenvolvimento embrionário do coração no ratinho foiestudado nos Capítulos 3 e 5. Há dois tipos de defeitos cardíacos em ratinhoshomozigotas para mutação nula de Tbx3: defeitos cardíacos severos, em que o coraçãonão completa a etapa de looping do tubo cardíaco, e defeitos cardíacos menos severos,em que o processo de looping é completado mas que o restante processo deremodelação é ainda afectado. Neste caso, Tbx3 é necessário para o estabelecimento daparede compacta do ventrículo, para a formação do sulco externo correspondente aosepto inter-ventricular e o septo inter-ventricular e para a septação do conus truncus.Numa tentativa de atrasar a letalidade dos embriões de ratinho homozigotas para amutação nula de Tbx3, foi gerada uma mutação hipomórfica de Tbx3. Embriões deratinho transheterozigotas sobrevivem por um período de gestação mais alargado edemonstram defeitos no membro anterior semelhantes a pacientes que sofrem dehaploinsuficiência de TBX3 ou síndrome ulnar-mamário. Estas observações sugerem queos defeitos cardíacos serão menos severos, e mais representativos da realidade médica.Assim sendo, o coração destes embriões apresenta defeitos no septo entre os ventrículo, àsemelhança de alguns pacientes sofridores de síndrome ulnar-mamário. A futuraobtenção de um modelo murino deste sindroma ajudará o estudo das malformaçõescardíacas e indicará uma via de tratamento com o objectivo de aumentar a qualidade de vida destes pacientes.
The vertebrate heart is a complex organ that develops from two lateral cardiacfields that migrate and fuse into a linear heart tube. The linear heart tube undergoesextensive remodeling that includes heart looping and chamber formation. Throughoutthese complex morphogenetic processes, differential gene expression, cell proliferation,differentiation, migration and cell shape changes are coordinated to produce thevertebrate multi-chambered heart. How regulation of these processes spatially and in tight synchrony with the needs of the development of the embryo is achieved is still largely unknown. T-box (Tbx) genes are transcription factors that are regionally expressed in the heart tube during cardiac development and are crucial players in these processes. The aim of this thesis was to determine the role of Tbx2 and Tbx3 during heart development. In Chapter 2, we search for zebrafish orthologues of Tbx2 and Tbx3 genes and analyze their expression pattern and knock down in zebrafish embryos. Zebrafish tbx2a and tbx3b display expression patterns that correlate with the expression pattern of their counterparts in higher vertebrates. Knock down of tbx2a and tbx3b function in zebrafish embryos generates a set of embryonic malformations that include defects in heart development. In Chapter 3, we analyze the cardiac defects caused by depletion of tbx2a and tbx3b. We show that, although patterning of the linear heart tube is not perturbed at the level of expression of cardiac markers, tbx2a and tbx3b are required for the formation of the atrioventricular canal. In Chapter 4, we assess the expression of major cardiac markers during heart development and show that zebrafish anf, bmp2, bmp4, bmp10 and versican are expressed throughout the extent of the linear heart tube and only after cardiac remodeling is initiated does their expression become spatially restricted. In Chapter 3 and 5, we study the cardiac defects of a mouse line bearing a mutant allele of Tbx3. Tbx3 mutant embryos present a range of severity of cardiac defects, which we divided into severe and mild classes. The severe class of Tbx3 mutant mice display defects in heart looping comparable to cardiac defects caused by of knock down of zebrafish tbx3b. The mild class of Tbx3 mutant embryos survives longer and presents defects in the ventricular myocardial wall and outflow tract septation. Together, the results presented here demonstrate that Tbx2 and Tbx3 are crucial players in several steps of heart development.
Descrição: Tese de doutoramento em Biologia (Biologia do Desenvolvimento), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008
URI: http://hdl.handle.net/10451/1531
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