Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15451
Título: Somitogenesis and fibronectin: united by tension?
Autor: Pinheiro, Gonçalo Goulart da Silva, 1991-
Orientador: Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-
Palavras-chave: Biologia do desenvolvimento
Hibridação in situ
Somitogénese
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: A somitogénese é um processo conservado em vertebrados, responsável pela determinação da segmentação do sistema musculo-esquelético que permitiu a adaptação dos métodos de locomoção aquática a ambientes terrestres. A extrema importância do correcto desenvolvimento deste processo para a formação do embrião fez com que a rede regulatória responsável por coordenar este processo tivesse evoluído para uma das mais complexas observáveis no embrião. Todos os dias novos intervenientes neste processo são descobertos, tornando-se cada vez mais óbvio que este é de facto um processo altamente complexo e robusto, garantindo vias alternativas de regulação em caso de falhas no sistema. Para tentar explicar, de uma forma simplificada e teórica, o modo de regulação do processo de somitogénese, no século passado vários modelos foram propostos. Hoje em dia o modelo mais aceite é o de “Clock and Wavefront”. Este modelo, proposto em 1976 por Cooke and Zeeman, supoe a existência de uma interacção de factores, cuja produção é cíclica, que marca o “tempo” que as células passam numa zona indeterminada da mesoderme paraxial. Associada a esta ciclicidade de factores encontra-se-ía um gradiente de um outro factor, distinto dos primeiros, que seria responsável por determinar a maturidade das células. Quando células que já passaram por um certo número de ciclos atingem uma determinada região do gradiente, estas interpretariam a combinação de ambos os sinais como informação para se diferenciarem e aglomerarem, formando um novo sómito. Desde a proposta deste modelo, vários genes foram descobertos que suportam este processo de regulação da somitogénese. Estes foram associados ao “relógio” molecular, quer como fazendo parte, quer como sendo regulados por ele, contando-se entre eles os genes hairy/hes, meso/mesp e lunatic fringe, e os genes aparentemente responsáveis pela determinação do gradiente caudal foram identificados, sendo eles raldh (responsável pela transformação de retinaldeído em ácido retinóico) e fgf8. Para além destes genes muitos outros foram sugeridos como participantes no processo de somitogénese. Ephrinas, caderinas, integrinas, fibronectina, sonic hedgehog e WNT’s foram associados ao processo de somitogénese uma vez que os mutantes para cada um dos genes, para além de outros defeitos, apresentam interrupção ou perturbação do processo de somitogénese. De entre estes, um gene que suscitou bastante interesse foi o de Fa. Há muito que se sabe que a FNa é um componente da matriz extracelular importante para vários processos durante o desenvolvimento do embrião. Embriões mutantes para fibronectina apresentam incapacidade de formar sómitos. No entanto, o papel exacto da matriz de fibronectina neste processo mantém-se pouco claro. Certamente que em parte funcionará como suporte físico, mas um número crescente de estudos têm surgido que demonstram que a matriz extracelular não serve apenas de “andaime” para as células, mas contém de facto informações químicas e físicas muito importantes para os processos de morfogénese que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário. Dois destes estudos tiveram como foco do seu trabalho a própria fibronectina, e o seu papel na regulação do processo de somitogénese. Rifes et al. e Rifes e Thorsteinsdóttir, em 2007 e 2012, respectivamente, demonstraram que: (1) a fibronectina é expressa pela ectoderme e montada em redor da mesoderme presomítica, (2) que sem a ectoderme e matriz a somitogénese pára, (3) e que a matriz existe num gradiente decrescente de complexidade, de anterior para posterior, levando à proposta de que o gradiente poderia estar a criar um gradiente de signalização física, participante provável na regulação da somitogénese. Neste trabalho propusémo-nos em testar esta hipótese, focando-nos em particular no efeito que a perda de sinalização física (i.e. tensão) celular tem na matriz e no processo da somitogénese, e por sua vez que efeitos tem a disrupção da matriz na regulação da somitogénese. Começámos por realizar hibridações in situ para os genes fn1 e itga5 (respectivamente o gene que codifica para fibronectina em galinha e o gene que codifica o seu principal receptor na mesoderme paraxial) nos primeiros 12 estádios de desenvolvimento embrionário da galinha, in ovo, e a fazer imunomarcação para a proteína de fibronectina. Observámos que o padrão de expressão destes genes se correlaciona intimamente com o padrão de montagem da matriz de fibronectina nos primeiros quatro estádios do desenvolvimento. Após esses 4 estádios a correlação contínua muito forte, mas começa a ser observável a existência de alguns tecidos que mostram montagem de matriz, mas não expressão do receptor, indicando a participação de outros receptores. É também observável o aparecimento de tecidos que expressam fibronectina, mas não o seu receptor, e tecidos que apenas expressam o receptor, mas onde existe montagem da matriz. Isto indica, como já tinha sido sugerido por Rifes et al., em 2007, que alguns tecidos produzem a matriz de FNa que outros irão montar, actuando esta como uma espécie de factor “parácrino”. A seguir decidimos testar o efeito da perda de tensão na montagem de novo e manutenção da matriz e na morfologia dos sómitos, em explantes de embriões entre o estádio HH10 e HH13. Ao cultivar com RockOut, uma droga que inibe a fosforilação da Rho cinase III (ROCK), responsável pela estimulação da contracção da miosina não-muscular II, observámos um decréscimo acentuado da montagem da matriz de fibronectina, tanto após 6h de cultura como após 12h. Observámos também uma perturbação do processo de epitelialização dos sómitos, tanto nos sómitos formados antes como durante cultura, correlacionado com alterações na matriz de laminina. Enquanto que após 6h de cultura a epitelialização parece bastante afectada, a matriz de laminina encontra-se mais densa. Após 12h, quando a epitelialização parece já ter recuperado, tendo um aspecto mais normal, a densidade da matriz de laminina também se aparenta mais com a observada nos explantes controlo. Isto sugere que a matriz de FNa é importante para a epitelialização dos sómitos, mas caso esta se apresente perturbada a matriz de laminina tem a capacidade de compensar por ela, permitindo uma epitelialização correcta, ainda que com um atraso de pelo menos 6 horas. Por fim decidimos analisar de que modo alguns genes, conhecidos por fazerem parte da regulação da somitogénese, são afectados pela perda de tensão. Para isso procedemos à cultura de explantes bissectados, nos quais as estruturas axiais foram divididas equitativamente por ambas as metades, de modo a cultivarmos cada metade num meio diferente, servindo uma de controlo à outra. Este método permitiu-nos observar que a expressão dos genes responsáveis pela montagem da matriz de fibronectina não é afectada pela falta de tensão, mas que a expressão dos genes responsáveis pela frente de determinação da mesoderme pré-somítica sofre um ligeiro avanço rostral e que os genes de expressão cíclica, hairy1 e meso1, apresentam um atraso na sua expressão. Estes resultados sugerem um atraso geral nos mecanismos celulares, tanto na maturação celular como na formação de novos sómitos. Todos juntos, estes resultados indicam que a tensão celular é importante para o correcto estabelecimento da matriz extracelular da mesoderme paraxial, que por sua vez é muito importante para a correcta e atempada epitelialização dos sómitos, inicialmente auxiliada pela matriz de fibronectina, mas que pode ser compensada mais tarde pela matriz de laminina.
Somitogenesis is the founding morphogenetic process to all the skeletomuscular components of the vertebrate body. To describe the regulation of this process, in 1976, Cooke and Zeeman postulated the “Clock and Wavefront” model. From then on several genes have been found to be responsible for the regulation of somitogenesis through the process suggested by Cooke and Zeeman. Hairy1, Hairy2, Lunatic Fringe, Meso1 and Notch have been, in chicken, associated with the “clock” part of the model, where Fgf8 and retinoic acid have been associated with the “wavefront” part. Besides this regulatory network, other genes have been found to influence somitogenesis, like Wnt family genes, Sonic Hedgehog, BMP’s and others. One of these genes, Wnt3a, was proposed in 2004, by Schmidt et al., to be the gene that confers ectoderm its indispensable role in somitogenesis. In 2007 Rifes et al. proposed that the gene responsible for the ectoderm’s essential role was FN. In this work the authors showed that the unavailability of both the ectoderm and the FN matrix led to an arrest of somite formation, while with one or the other this arrest would not happen. It was proposed that the FN matrix, produced by the ectoderm and assembled by the paraxial mesoderm, would be essential for somitogenesis, and it’s role is to confer the proper tension information to the presomitic mesoderm (PSM), which might be indispensable for the PSM’s correct and timely maturation. In this work we continue the exploration of this hypothesis. First we analyzed the expression patterns of fn1 and itga5 (the α chain of the major FN receptor, the α5β1 integrin) and how they correlate with matrix assembly in the early embryo, from stage HH1 to HH12. Then we cultured explants in RockOut, a Rho kinase III inhibitor that leads to the disassembly of non-muscle myosin II (resulting in a loss of tension) and assessed the effects on morphology and matrix assembly. Finally, we produced bisected explants that were also cultured with RockOut to test for effects on the genetic regulation of somitogenesis. We conclude that loss of tension leads to a delay in somite formation and epithelialization, which is later compensated by an increase in laminin matrix deposition.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15451
Designação: Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento
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