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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/1552

Título: Regulation of vascular-endothelial-growth-factor : al-te-rnative s-pli-Cing : by tissue microenvironment
Autor: Elias, Ana Paula Batista, 1979-
Orientador: Dias, Sérgio Jerónimo Rodrigues
Barroso, José Manuel Gonçalves, 1955-
Palavras-chave: Carcinoma do endométrio
Ciclo éstrico
Splicing alternativo
Variacões do micro-ambiente
VEGF
Biologia celular
Teses de doutoramento
Issue Date: 2008
Resumo: O factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) tem sido um factor descrito como fundamental para a correcta formação da rede capilar durante a embriogenese, mas também para a formação de novos vasos sanguíneos durante a vida de um organismo adulto. O VEGF tem um papel activo nos dois processos que se sabe serem importantes para a formação de uma nova vasculatura, sendo eles a vasculogénese (formação de novos vasos a partir de progenitores endoteliais) e a angiogénese (formação de novos vasos a partir de vasos pré-existentes), e que no adulto ocorrem numa grande variedade de situações quer fisiológicas (por exemplo durante a cicatrização de uma ferida ou na reparação do endométrio após menstruação) quer patológicas (por exemplo na vascularização de um tumor ou num processo de artrite reumatóide). Para além de actuar ao nível das células endoteliais que constituem os vasos, este factor de crescimento também foi descrito como capaz de actuar em células tumorais, promovendo não só a sua sobrevivência mas também a sua migração. O VEGF é codificado por um gene que após splicing alternativo entre os exões 5 e 8 do pré-mRNA, origina diversas isoformas (as isoformas VEGF121, VEGF145, VEGF165 e VEGF189 são as isoformas mais abundantes). A existência de splicing alternativo neste gene faz com que se formem diferentes isoformas com diferentes localizações, uma vez que os exões em causa codificam para domínios de ligação à heparina que se pode encontrar tanto na membrana celular como na matriz extracelular. A isoforma 121 do VEGF não contem os exões 6 e 7 e dessa forma é uma isoforma capaz de se difundir e actuar a longas distâncias. Ao contrário, a isoforma 189 tem na sua constituição quer o exão 6 quer o exão 7 e portanto encontrase localizada junto à membrana da célula e retida na matriz extracelular, podendo no entanto ser clivada por uma protease e desta forma ter a mesma localização da isoforma 121. As isoformas 145 e 165, que tem o exão 6 e o exão 7 respectivamente, tem propriedades intermédias e podem sinalizar junto da membrana da célula ou a distâncias maiores. Para além da diferente localização, as várias isoformas têm consequentemente diferentes afinidades para os receptores do VEGF. Por exemplo Apesar de existirem descritos vários trabalhos sobre o controlo ao nível da transcrição do VEGF (e.x. a hypoxia é um factor importante capaz de induzir a expressão do VEGF através da proteína HIF-1 que se liga à região promotora do VEGF), os mecanismos responsáveis pela regulação do splicing alternativo deste gene não são conhecidos. Sendo assim, os objectivos deste trabalho consistiram não só na caracterização dos sinais externos capazes de induzir uma alteração do padrão de isoformas do VEGF mas também na pesquisa das vias de sinalização e proteínas envolvidas na regulação do splicing alternativo deste gene em resposta a um sinal externo. De uma forma resumida, neste trabalho demonstrou-se in vitro que uma mudança do pH extracelular de neutro para ácido era capaz de induzir uma alteração no padrão de isoformas do VEGF. Mais detalhadamente, a percentagem da isoforma 121 do VEGF nesta condição estava bastante aumentada quando comparada com a sua percentagem numa condição de pH neutro. Esta alteração do splicing alternativo do VEGF demonstrou-se estar associada à activação da via de sinalização da cinase p38 (a adição de um inibidor específico da via manteve o padrão de isoformas do VEGF igual ao controlo mesmo depois de se ter sujeitado as células a um pH ácido). A caracterização das proteínas capazes de controlar o splicing alternativo do VEGF em resposta ao pH ácido e à activação da via da cinase p38, não está ainda totalmente concluída, no entanto, através de métodos bioinformaticos e de técnicas de RNAi, a proteína Tra2ß ( proteína reguladora do splicing alternativo relacionada com a família das proteínas SR que são caracterizadas por terem domínios ricos em serina/arginina e um domínio de ligação ao pré-mRNA) parece estar envolvida no Outras proteínas já descritas como envolvidas no controlo do splicing alternativo, como é o caso das proteínas hnRNP (proteínas antagonistas das proteínas SR que se ligam a locais de silenciamento existentes tanto nos exões como nos intrões dos prémRNA), poderão estar a regular directamente a expressão das diferentes isoformas do VEGF. Para alem destas proteínas, também os RNAs não codificantes tem sido mais recentemente implicados no controlo do splicing alternativo dos genes e poderão também estar a afectar o VEGF. Pela analise das isoformas do VEGF, tanto nos ovários como no útero, durante o ciclo éstrico de ratinho (angiogenese fisiológica), verificou-se que a isoforma 121 parecia ser a primeira a ser induzida numa condição de stress provocada pela ruptura do tecido/vasos (no ovário após ovulação e no endométrio aquando da descamação resultante da não fertilização do óvulo). De seguida a expressão da isoforma 165 e por fim da isoforma 189 parecia ser importante para a correcta formação e estabilização dos vasos. Este ciclo de expressão das isoformas do VEGF verificou-se não existir numa condição tumoral (angiogenese patológica). De acordo com os resultados obtidos em tumores do endométrio, o padrão de expressão das isoformas do VEGF é diferente do de uma condição não tumoral e notou-se um aumento na percentagem de todas as isoformas excepto da isoforma 165 que era a isoforma predominante nestes tecidos (chega a reduzir de 61% para 33%). Também por imunohistoquímica se verificou que na micro-vasculatura de tumores mais agressivos não havia uma correcta formação vascular o que poderia ser resultante da alteração do padrão de isoformas do VEGF. Em suma, este trabalho veio clarificar a importância de alterações do micro-ambiente celular, nomeadamente da acidez (que se sabe ocorrer durante um processo tumoral em consequência do aumento da respiração anaeróbia por parte das células tumorais), no controlo do splicing alternativo do VEGF. Estes resultados são relevantes não só para o conhecimento básico da regulação génica do VEGF mas também poderá ter uma grande relevância no contexto da angiogenese patológica, uma vez que os defeitos na funcionalidade destes vasos, por exemplo em tumores, é muitas vezes responsável pela não eficácia dos tratamentos anti-tumorais (os vasos por serem muito permeáveis não são capazes de transportar correctamente as drogas administradas até ao seu alvo, o tumor). Sendo assim, o conhecimento pormenorizado da regulação deste gene pode ter um papel importante na abordagem terapêutica dos tumores.
VEGF has been described to be important for new blood vessels formation in a huge number of situations. Besides acting on endothelial cells this growth factor can also act in tumoral cells, having in that case a role in cell survival and migration. This gene encodes for several proteins generated by alternative splicing (VEGF121, 145, 165, and 189 being the most abundant ones). Due to its different properties, VEGF121 has been implicated in the recruitment of the peripheral vessels at long distances, and VEGF189 seems to have a role in the branching of the microvessels being limited to its expression site. Although some previous work focused on the control of VEGF expression, the mechanisms that regulated the alternative splicing of VEGF was not known, so the aims of our work were to characterize the extracellular signal, signaling pathways and proteins involved in the regulation of this process. Briefly, we showed in vitro that a change in extracellular pH (acidosis) could induce a significant increase in the percentage of VEGF121. This change was shown to be mediated by activation of the p38 stress signaling pathway. Finally, we speculate that the SR related protein, Tra2ß, may have a role in VEGF121 up-regulation, in response to acidic conditions and p38 activation. Interestingly, we observed that in a physiologic angiogenic process, VEGF121 seems to be the first isoform to be induced after vessels/tissue disruption. Than VEGF165 and finally VEGF189 seems to be important for the proper vessels formation and stabilization. This cyclic expression of VEGF isoforms was shown to be absent in the tumoral pathologic angiogenesis. Taken together we were able to highlight the importance of microenvironment changes in the control of VEGF alternative splicing that could be of extreme importance in the context of pathologic angiogenesis.
Descrição: Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008
URI: http://sibul.reitoria.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000537554
http://hdl.handle.net/10451/1552
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