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Título: Estudo calorimétrico do efeito do H2O2 no metabolismo da Saccharomyces cerevisiae
Autor: Semedo, Valdir Avelino Rocha
Orientador: Antunes, Fernando José Nunes, 1969-
Piedade, Manuel Eduardo Ribeiro Minas da, 1957-
Palavras-chave: Peróxido de hidrogénio
Metabolismo
Microcalorimetria
Saccharomyces cerevisiae
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: O trabalho desenvolvido nesta tese encontra-se inserido num projecto que tem como objectivo a longo prazo investigar a aplicação do peróxido de hidrogénio (H202), o principal oxidante da célula, como fármaco. Nesta tese, aplicou-se pela primeira vez um método calorimétrico para estudar alterações metabólicas induzidas pela adição de H2O2 em células de Saccharomyces cerevisiae. Utilizaram-se dois calorímetros: um microcalorimetro de fluxo LkB 10700-1 e um microcalorímetro de batch TAM LKB 2277. O trabalho implicou o desenvolvimento de vasos reaccionais para ambos os calorímetros e a optimização das condições experimentais de modo a conseguir detectar as variações de energia associadas ao metabolismo celular e suas alterações. Os principais resultados obtidos foram: (1) determinou-se a constante de calibração, o volume efectivo e o tempo de residência na célula calorimétrica do microcalorímetro de fluxo LKB 10700-1; (2) as curvas de crescimento da Saccharomyces cerevisiae obtidas por calorimetria para a estirpe selvagem (wt), para as estirpes com deleção do gene do catalase citosólico (ctt1) e com deleção de cinco genes de peroxirredoxinas (Δ5) foram semelhantes às obtidas por densidade óptica; (3) a análise calorimétrica mostrou a existência de oscilações do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae no seu crescimento normal e em alterações na taxa metabólica após exposição ao H2O2; (4) a potência dissipada pelas células das diferentes estirpes em fase exponencial do crescimento foi semelhante; (5) a resposta calorimétrica à adição de uma dose sub-letal (150 μM) de H2O2 foi semelhante nas estirpes wt e ctt1, mas na estirpe Δ5 foi cerca de metade e foi necessário um período superior para que o metabolismo anterior à adição de H2O2 fosse recuperado. Em conclusão, neste trabalho a calorimetria foi aplicada com sucesso ao estudo em tempo real dos efeitos biológicos do H2O2 em células vivas.
The work carried out on this thesis is part of a project whose long-term aim is to investigate the application of hydrogen peroxide (H202), the main oxidant of the cell, as a pharmacological agent. In this thesis, for the first time a calorimetric method was applied in order to study metabolic modifications induced by the addition of H2O2 to Saccharomyces cerevisiae cells. Two calorimetric techniques were used: flux and batch microcalorimetry performed in LKB 10700-1 and LKB TAM 2277 models, respectively. The work implied the development of reaction vessels for both calorimeters and the optimization of experimental conditions in order to succeed in detecting the energy modifications associated to the cellular metabolism and its response to H2O2. Main results were: (1) calibration constant, the volume of the calorimetric cell and the time of residence in the cell were determined for the LKB 10700-1 model; (2) growth curve of Saccharomyces cerevisiae for the wild-type strain (wt), for the strain deleted in the cytosolic catalase gene (ctt1), and deleted in five peroxiredoxin genes (Δ5) obtained by calorimetry compared well with that observed by optical density; (3) calorimetric analysis showed the existence of oscillations in the metabolism of Saccharmyces cerevisiae during his normal growth and alterations in the metabolic rate after exposure to H2O2; (4) a similar power is dissipated by cells from the three strains studied during their exponential phase of growth; (5) the calorimetric response to the addition of a sub-lethal dose (150 μM) of H2O2 is similar in the wt and ctt1 strains, but in the Δ5 strain approximately half of the response was observed and a longer period was needed to recover the metabolic response observed before H2O2 addition. In conclusion, in this work calorimetry was successfully applied to investigate the real-time response of living cells to non-lethal H2O2 doses.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15540
Designação: Mestrado em Bioquímica
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