Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15575
Título: Avaliação da expressão de genes envolvidos na síntese de microcistinas em cianobactérias tóxicas sujeitas a diferentes intensidades de luz
Autor: Salvador, Daniel Fernando da Fonseca, 1991-
Orientador: Valério, Elisabete Maria Pinto, 1977-
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Palavras-chave: Cianobacterias
Expressão génica
Microcistinas
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: As cianobactérias são um grupo de microrganismos fitoplanctónicos, procariotas unicelulares, aeróbios e autotróficos. Encontram-se difundidos numa ampla variedade de habitats, ainda assim, são especialmente comuns em ambientes de água doce. A maioria das espécies existe normalmente em baixas concentrações no ambiente, no entanto, quando as condições ambientais são favoráveis, as células podem proliferar massivamente, levando à formação de florescências (blooms). Os blooms são um problema bastante actual e crescente em todo o mundo, dado que por vezes podem ser tóxicos e causar intoxicações e até a morte. A sua toxicidade resulta da capacidade que algumas espécies de cianobactérias produzirem toxinas. Dos vários grupos de cianotoxinas, as hepatotoxinas são umas das que mais frequentemente estão relacionadas com intoxicações. Deste grupo, as microcistinas são as mais comuns em corpos de água doce portugueses. A crescente consciencialização dos seus riscos tem resultado em vários estudos para compreender o seu mecanismo de síntese e os factores que podem regular/influenciar o mesmo. A síntese das microcistinas é não ribossomal, a partir de um mecanismo característico de tio-molde, e utilizando complexos multienzimáticos codificados pelos genes mcy. Relativamente aos factores regulatórios, diversos estudos têm vindo a demonstrar que os factores ambientais podem induzir alterações na concentração/produção de cianotoxinas, designadamente o pH, a concentração/proporção de nutrientes, a temperatura e a intensidade de luz. No entanto a informação existente não é consensual. Assim, este estudo tem como objectivo principal avaliar a influência da intensidade de luz na transcrição do gene mcyA e correspondente produção de microcistina em diferentes cianobactérias tóxicas. Simultaneamente pretendeu-se avaliar a influência das diferentes intensidades de luz na taxa de crescimento e ainda avaliar diferentes genes de referência para a normalização da expressão génica, obtida em RT-qPCR. Foram utilizados dois isolados produtores de microcistina - Microcystis aeruginosa (LMECYA 7) e Planktothrix agardhii (LMECYA 256). As culturas foram expostas durante 18 dias a três diferentes intensidades de luz (4, 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1) a uma temperatura de 20 ± 1ºC. Diariamente recolheram-se amostras para avaliar o crescimento das culturas, através da medição da densidade óptica. Em cada fase do crescimento colheram-se também amostras (três vezes) para efectuar a contagem celular, quantificação das microcistinas pela técnica de ELISA e extracção de RNA. Neste trabalho foi avaliada a expressão do gene mcyA pertencente ao cluster mcy, por RT-qPCR. Para além disso, foram ainda estudados genes de referência (rRNA 16S, gltA e rpoC1). Verificou-se uma correlação entre a taxa de crescimento e a intensidade de luz, quer em M. aeruginosa, quer em P. agardhii. As taxas de crescimento em ambas as espécies foram menores a 4 μmol de fotões m-2 s-1 e maiores a 30 μmol de fotões m-2 s-1. As diferenças foram mais acentuadas entre o crescimento na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1 e o crescimento nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre estas últimas duas intensidades a taxa foi bastante semelhante. O efeito das diferentes intensidades de luz foi mais acentuado em M. aeruginosa do que em P. agardhii. As concentrações de microcistina por célula em M. aeruginosa foram semelhantes entre intensidades de luz, sobretudo nas duas primeiras fases do crescimento. Apenas na fase estacionária as concentrações de toxina diferiram consideravelmente, tendo a maior produção ocorrido a 30 μmol de fotões m-2 s-1 e a menor a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii houve maiores diferenças na concentração de microcistina por célula entre intensidades de luz e fases do crescimento. A maior produção ocorreu a 4 μmol de fotões m-2 s-1 na fase estacionária e a menor a 20 μmol de fotões m-2 s-1 na fase exponencial de crescimento. Relativamente à estabilidade dos genes de referência, o gene rRNA 16S foi o menos estável em M. aeruginosa, mas o mais estável em P. agardhii, tendo em conta os algoritmos geNorm e NormFinder. O gene rpoC1 foi o mais estável em M. aeruginosa e o menos estável em P. agardhii, tendo em consideração os mesmos algoritmos. Usando o algoritmo BestKeeper, o gene gltA foi classificado como o mais estável em ambas as espécies. Utilizaram-se assim os genes rpoC1 e gltA em M. aeruginosa e os genes rRNA 16S e gltA em P. agardhii na normalização da expressão do gene mcyA. A expressão do gene mcyA nas três fases do crescimento em M. aeruginosa foi sempre significativamente diferente entre a intensidade 4 μmol de fotões m-2 s-1 e as intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1, sendo que entre estas duas últimas a expressão foi semelhante. A maior expressão deu-se na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii, apenas nas duas últimas fases do crescimento a expressão do mcyA foi significativamente diferente entre as várias intensidades luz. Nas duas últimas fases, os níveis de expressão de mcyA nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1 foram inferiores ao nível de expressão a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre as duas intensidades de luz mais altas a expressão foi muito idêntica. A análise da evolução temporal da expressão do gene mcyA em cada intensidade de luz mostrou que em M. aeruginosa, de uma forma geral, a expressão variou sobretudo entre a fase de adaptação e a fase exponencial de crescimento. Os níveis de expressão foram máximos na fase de adaptação nas três intensidades de luz. Em P. agardhii, os níveis de expressão de mcyA ao longo do tempo não variaram igualmente nas três intensidades de luz. Ainda assim, a maior expressão observou-se na fase exponencial de crescimento. Não se verificou correspondência entre a expressão génica e a quantidade de microcistina efectivamente produzida por célula em nenhuma das espécies, pois as alterações verificadas na expressão de mcyA ao longo do tempo não foram acompanhadas por variações no mesmo sentido da quantidade de microcistina por célula. Conclui-se assim, que as intensidades de luz testadas influenciaram tanto o crescimento, como a produção de microcistina, como a expressão do gene mcyA, ainda que de forma diferente em M. aeruginosa e P. agardhii. Revelando que ainda há muitas questões em aberto que necessitam de ser esclarecidas em estudos futuros.
Cyanobacteria are phytoplanktonic organisms widely occurring in freshwaters, being frequently associated with the production of toxins, namely microcystins. Microcystins are produced non-ribosomally, by a multienzyme complex (mcy genes). It is believed that environmental factors such as pH, temperature, concentration/ratio of nutrients and light intensity can influence toxin production. The aim of this study was assess the influence of light intensity, in the transcription of the mcyA gene and corresponding production of microcystins in toxic isolates of Microcystis aeruginosa and Planktothrix agardhii. For that purpose, cultures were exposed to three different light intensities (4, 20 and 30 μmol photons m−2 s−1) for 18 days at 20 ± 1ºC. The growth was followed daily by measuring the optical density. At each growth stage samples were collected for cell counting, microcystins quantification by ELISA and RNA extraction. The level of transcripts was quantified by RT-qPCR and the relative expression determined using three reference genes, rRNA 16S, gltA and rpoc1. The most stable reference genes in M. aeruginosa were rpoC1 and gltA whereas in P. agardhii were rRNA 16S and gltA. There was a correspondence between the growth rate and intensity of light in M. aeruginosa and P. agardhii. The growth rates for both species were smaller at 4 and greater at 30 μmol photons m-2 s-1. The microcystin concentration per cell was similar among light intensities and over time in M. aeruginosa, while in P. agardhii the concentration was higher in the stationary phase at 4 μmol photons m-2 s-1. There were differences in the expression of mcyA between the two species. In M. aeruginosa, the highest levels of expression occurred at 4 μmol photons m−2 s−1 in the adaptation phase, whereas for P. agardhii it was at 4 μmol photons m−2 s−1 in the exponential growth phase. The mcyA expression was influenced by light intensity and growth phase. There was no association between gene expression and the quantity of microcystin produced per cell in any of the species. Our results indicate that the light intensities tested influenced the growth, microcystin production and mcyA expression levels, although differently in M. aeruginosa and P. agardhii.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15575
Designação: Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
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