Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15735
Título: Engineering new bacterial dye-decolourising peroxidases for lignin degradation
Autor: Tavares, Diogo Alexandre Martins Aires, 1991-
Orientador: Martins, Lígia Oliveira
Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-
Palavras-chave: Biocatalisadores
Catalizadores enzimáticos
Mutagénese
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Dye-decolourising peroxidases (DyPs) are a novel family of heme-containing peroxidases showing a high efficiency for a wide number of substrates, including synthetic dyes, lignin units and metals, and are thus very attractive biocatalysts for application in the environmental and industrial biotechnology fields. In this work high-throughput protocols were optimized and validated for the application of directed evolution approaches targeting PpDyP from Pseudomonas putida MET94 at the level of cell growth, lysis and enzymatic assays. Libraries of variants were created by epPCR and DNA shuffling techniques and explored for activity using high-throughput screenings activity assays. Four libraries of variants in a total of 8163 clones were explored in three rounds () of molecular evolution rounds to improve the efficiency for substrates and stability of PpDyP. The best variants were overproduced and purified and their structural and catalytic properties were characterized by spectroscopic and kinetic approaches. One variant, 21G11, was achieved showing 25- and 6-fold higher specificities (kcat/Km) for ABTS oxidation and H2O2 reduction, respectively. Importantly, variant 6E10, showing a 250-fold enhanced specificity for phenolics as compared with the wild-type was selected with a pHopt = 5.4, 1.1 units up-shifted in relation to the wild-type enzyme. Noteworthy a 2-fold increase in the protein production levels in relation to the wild-type was observed in both hit variants most probably related with the replacement of residue His125, for either a Arginine or Threonine, suggesting that this residue is a hot-spot in the enzyme structure to improve the protein production. Based in the model structure of PpDyP we have rationalized the structural molecular basis for increased activity for ABTS or DMP and improved kinetic stability and production yields of the PpDyP enzyme.
As ‘’dye decolourising peroxidases’’ (DyPs) são uma nova família de peroxidases hémicas que utilizam H2O2 e apresentam uma especificidade alargada para diferentes substratos, sendo de destacar o seu enorme potencial oxidativo para compostos aromáticos, tais como corantes sintéticos e unidades de lenhina fenólicas e não fenólicas. Devido à especificidade alargada, as DyPs podem ser utilizadas como biocatalizadores em diferentes aplicações biotecnológicas. Todos os anos 800 mil toneladas de corantes sintéticos são produzidos e ~ 15% são libertados para os efluentes. Os tratamentos convencionais para a remoção destes corantes dos efluentes são atualmente pouco eficazes e muito dispendiosos. Devido à grande capacidade oxidativa das DyPs, estas enzimas têm um grande potencial para serem utilizadas no tratamento destes efluentes. Noutro contexto, a biorefinaria de lignocelulose poderá vir a ser uma solução para reduzir a utilização de matérias primas fósseis, não renováveis, com implicações no aquecimento global, para a produção de biocombustíveis, materiais e produtos de elevado valor acrescentado. Novamente, as DyPs ao mostarem capacidade oxidativa de unidades fenólicas e não-fenólicas de lenhina, poderão ter um papel importante, como enzimas ligninolíticas na degradação de material lignocelulósico muito resistente à degradação química e biológica. As enzimas apresentam várias vantagens como catalizadores, são eficientes, específicas, seguras e amigas do ambiente, no entanto a sua eficiência e estabilidade por vezes ficam aquém das necessidades para a sua aplicação a nível industrial. As proteínas podem ser melhoradas usando técnicas de engenharia racional no entanto esta abordagem requer um conhecimento extenso e muitas vezes inantingível da relação entre estrutura e função das proteínas. Para ultrapassar esta limitação surgiu uma tecnologia chave na área da engenharia molecular, denominada evolução dirigida, tendo mostrado resultados impressionantes no melhoramento de várias características dos biocatalisadores. A evolução dirigida envolve 4 passos essenciais: (i) selecção do gene de interesse, (ii) construção da biblioteca de mutantes, (iii) selecção de proteínas mutantes com funções melhoradas, (iv) repetir o processo até o objectivo ser atingido. Os métodos mais comuns de mutagénese são a mutagénese aleatória, mutagenése por saturação e o ‘’DNA shuffling’’. A mutagénese aleatória consiste em pequenas modificações dos protocolos de PCR, modificações essas, que aumentam a normal taxa de erro da enzima Taq polimerase. Normalmente estes protocolos contêm maiores concentrações de MgCl2 em relação aos tradicionais com o objectivo de estabilizar os pares não-complementares. A taxa de mutação também pode ser aumentada através da adição de MnCl2 ou da variação do rácio de nucleótidos. A mutagénese por saturação permite a criação de uma biblioteca de mutantes, que contém todas as mutações possíveis numa posição alvo da sequência da proteína. Desta forma um amino ácido pode ser substituído por todos os 20 amino ácidos introduzindo todos os codões possíveis nessa posição. Por fim, o ‘’DNA shuffling’’ é uma técnica in vitro de recombinação aleatória dos mutantes seleccionados . O PCR reagrupa os genes a partir de fragmentos de DNA que são gerados por digestão aleatória prévia dos diferentes genes parentais. Recentemente no Laboratório de Tecnologia Microbiana e Enzimática o gene que codifica para uma DyP de Pseudomonas putida MET94 (PpDyP) foi clonado, expresso, e a proteína foi super-produzida e purificada. Esta enzima mostrou ser eficiente na degradação de corantes azo e antraquinónicos e na oxidação de compostos fenólicos e não-fenólicos e iões metálicos como o manganês e o ferro. Esta especificidade alargada para diferentes substratos torna esta enzima muito atractiva para ser utilizada como biocatalizador nas áreas da biotecnologia ambiental e industrial. O objectivo deste estudo foi estabelecer protocolos apropriados para a evolução dirigida da enzima PpDyP de form a então criar biocatalisadores de elevada performance para serem utilizados nas futuras biorefinarias. Nesse sentido, técnicas de evolução dirigida foram aplicadas à PpDyP. Quatro bibliotecas de mutantes, em três ciclos de evolução, foram construídas por técnicas de mutagénese aleatória e “DNA shuffling” e cerca de 8000 clones foram rastreados. Os melhores mutantes de cada geração foram produzidos e purificados e as suas propriedades espetroscópicas e catalíticas foram estudadas. Espectroscópicamente todos os mutantes revelaram ser semelhantes à estirpe selvagem, o que indica que as mutações introduzidas não levaram a nenhuma alteração estrutural significativa da enzima. Durante o processo de evolução foram seleccionados variantes com especificidades distintas. Os mutantes 9F6 e 21G11 revelaram uma melhoria de 6 e 25 vezes na especificidade (kcat/Km) (1 ordem de grandeza) para os substratos ABTS e H2O2, respectivamente, quando comparados com a estirpe selvagem. A especificidade dos mutantes 17F11 e 6E10 aumentou cerca de 250 vezes (3 ordens de grandeza) para o substrato DMP quando comparados com a estirpe selvagem. Os mutantes 21G11 e 6E10 apresentaram um rendimento de produção proteica duas vezes superior relativamente à enzima nativa. Foi interessante verificar que ambos adquiriram uma mutação na histidina125, sugerindo que este resíduo é um local importante para melhorar a produção da proteína. Foi verificado também ao longo deste trabalho que é muito difícil aumentar simultaneamente a actividade catalítica e a estabilidade da enzima. Os mutantes 9F6 e 17F11 são bons exemplos, uma vez que o aumento da actividade catalítica resultou numa menor estabilidade. Isto deve-se provavelmente ao compromisso que existe entre a actividade e a estabilidade proteica. Inúmeras vezes para continuar a melhorar a actividade catalítica de um variante têmde ser introduzidas previamente mutações neutras importantes na estabilização da estrutura. Introduzindo posteriormente novas mutações que melhorem a actividade catalítica da enzima. Neste trabalho a PpDyP foi evoluída com sucesso por técnicas de evolução dirigida, para maior capacidade oxidoreductiva para o ABTS, H2O2 ou para os compostos fenólicos e níveis de rendimento de produção melhorados.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15735
Designação: Mestrado em Biologia (Microbiologia Aplicada)
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
ulfc107502_tm_diogo_tavares.pdf1,36 MBAdobe PDFVer/Abrir


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.