Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15736
Título: Uncovering the role of host Cullin 3 during Plasmodium berghei liver stage infection
Autor: Cristo, Gabriela Stephanie Peres, 1985-
Orientador: Luis, Vanessa Alexandra Zuzarte
Zilhão, Rita, 1959-
Palavras-chave: Plasmodium berghei
Malária
Expressão génica
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: A malária é uma das principais doenças parasitárias do mundo, sendo a causa de mais de 1 milhão de mortes todos os anos. Causada por um parasita eucariota intracelular, do género Plasmodium, a malária é transmitida através da picada de um mosquito fêmea do género Anopheles. Entre as cinco espécies que podem transmitir malária aos humanos, Plasmodium falciparum é o principal contribuidor para a morbilidade e mortalidade associadas à malária. O ciclo de vida do parasita é complexo e envolve um vetor, o mosquito, e um hospedeiro vertebrado. Durante o ciclo de vida no hospedeiro, existem duas fases principais: a fase hepática e a fase sanguínea. A infeção começa quando o mosquito injeta esporozoítos de Plasmodium na pele do hospedeiro vertebrado. Depois de atravessar a derme os parasitas entram no sistema circulatório e vão para o fígado, onde completam a fase silenciosa do seu desenvolvimento. Esta etapa de desenvolvimento assintomática acabará por levar à libertação na corrente sanguínea de milhares de novos parasitas chamados merozoítos, iniciando a fase sintomática da doença. Nos seres humanos, a fase hepática da infeção dura cerca de 6-10 dias onde o número de parasitas expande enormemente, até 40.000 vezes. Esta elevada taxa de multiplicação impõe uma necessidade significativa de nutrientes. Tal como outros agentes patogénicos intracelulares, é plausível que o parasita tenha desenvolvido mecanismos para explorar os recursos da célula hospedeira, nomeadamente o seu sistema endomembranar. O sistema endomembranar de uma célula eucariota é composto por diferentes organelos secretores e vesículas da via endocítica. A via de endocitose desempenha um papel importante em várias funções biológicas, tais como, a absorção de nutrientes, sinalização celular, e eliminação de agentes patogénicos. No fígado, o parasita desenvolve-se rodeado por endossomas e lisossomas do hospedeiro, embora não se observe fusão e acidificação do vacúolo. Estas observações sugerem que, em vez de eliminar o parasita, as vesículas podem ter um papel importante no seu desenvolvimento durante a fase hepática. Na via endocítica, o sistema de ubiquitinação controla inúmeros processos celulares, nomeadamente na regulação da sinalização e reciclagem dos receptores de membrana. O sistema ubiquitina é uma modificação pós-tradução que consiste na ligação de uma proteína ubiquitina a um substrato. O último passo de conjugação da ubiquitina à proteína alvo é catalisado por uma enzima E3 ligase, responsável pelo reconhecimento específico dos substratos. Os Cullin-RING ligases (CRLs) constituem a maior classe conhecida de E3s. Os CRLs são complexos proteicos constituídos por uma proteína estrutural (Cullin), que em mamíferos é composta por uma família com seis homólogos (Cullin 1, Cullin 2, Cullin 3, Cullin 4a, Cullin 4b, e Cullin 5); uma proteína com um domínio de ligação à ubiquitina; e uma proteína de ligação ao substrato. Estas últimas são variáveis e conferem especificidade de ligação ao substrato. Recentemente, a Cullin 3 surge como um importante regulador do tráfico vesicular, em particular na secreção e maturação dos endossomas. A depleção de Cullin 3 resulta em defeitos no transporte da carga dos endossomas para os lisossomas. Dada a importância da associação do sistema endolisossomal durante o desenvolvimento do parasita dentro do hepatócito e o papel da Cullin 3 na via endocítica, o principal objetivo deste projeto foi avaliar o papel da Cullin 3 durante o desenvolvimento intra-hepático de Plasmodium. Para isso, utilizámos o modelo de roedores Plasmodium berghei, e realizámos ensaios funcionais de ganho ou perda de função, sobre-expressão de Cullin 3; bloqueio da ativação da Cullin 3 usando um inibidor de nedilação (MLN4924), e depleção da Cullin 3, usando siRNA. Começámos por verificar se a sobre-expressão transiente de Cullin 3 iria causar algum efeito sobre a infeção por Plasmodium, bem como na acumulação de vesículas em torno do parasita. Células HeLa foram transfetadas com um plasmídeo expressando Cul3-Myc; 36 horas após a transfeção as células foram infetadas com esporozoítos de Plasmodium berghei que expressam Green Fluorescent Protein (GFP). A análise de três experiências independentes, feita por microscopia às 48 horas após a infeção, não permitiu identificar um número suficiente de células transfetadas e infetadas para poder tirar conclusões sobre o efeito da sobre-expressão da Cullin 3 na infeção por Plasmodium. A razão para isto foi a combinação da baixa taxa de transfeção (30%) com a extrema baixa taxa de infeção de células HeLa por Plasmodium (<1%). “Nedilação” é um tipo de modificação pós-tradução de proteínas, que envolve a adição da molécula ubiquitina-NEDD8 à proteína alvo. Muitos estudos mostraram que a “nedilação" desempenha um papel importante na ativação dos Cullin-RING ligases. MLN4924 é uma pequena molécula inibidora da atividade da NEDD8 activating enzyme (NAE) que se liga a um sítio ativo designado de NEDD8-MLN4924. Como resultado, a “nedilação” das Cullins é bloqueada levando à inactivação dos complexos CRL/SCF (Cullin-RING-ligases / Skp1-Cullin-F box proteins) e, consequentemente, à acumulação de vários substratos dos Cullin-RING ligases. Logo, o próximo passo foi avaliar o bloqueio da ativação da Cullin 3 usando o inibidor da “nedilação” MLN4924, durante a infeção por Plasmodium. A grande vantagem do inibidor MLN4924 é a sua elevada especificidade para a inibição dos Cullin-RING ligases. Além disso, MLN4924 é um composto já aprovado pela FDA (Food and Drug Administration). Neste estudo, utilizámos células de hepatoma humanas (Huh7) que foram submetidas a 24 horas de tratamento com MLN4924 antes da infeção com parasitas Plasmodium berghei expressando GFP. Os níveis de infeção durante a invasão e o desenvolvimento do parasita foram analisados por citometria de fluxo e microscopia. Os nossos resultados demonstraram que, aparentemente, não há efeito significativo nos níveis de infeção por Plasmodium durante a invasão e o desenvolvimento. No entanto, devido ao facto do tratamento das células com MLN4924 provocar expressivas alterações celulares, não pudemos determinar concretamente o efeito do bloqueio da ativação da Cullin 3 durante a infeção por Plasmodium. Para avaliar o papel da Cullin 3 durante a infeção por Plasmodium de uma forma mais específica, utilizámos short interfering RNA (siRNA) para causar a depleção da Cullin 3 em células Huh7. As células foram transfetadas com siRNA para a Cullin 3, e após 36 horas de depleção foram infetadas com parasitas expressando GFP. Os níveis de infeção foram analisados por Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) e microscopia. Os resultados obtidos após 48 horas de infeção sugerem que a depleção da Cullin 3 por siRNA provoca uma redução do número de células infetadas com Plasmodium. Em conclusão, os nossos resultados demonstram que o composto MLN4924 não tem efeitos significativos durante a infeção por malária na fase hepática. Além disso, este inibidor apresenta demasiados efeitos adversos sobre as células hospedeiras, de modo que, a interpretação dos resultados não é conclusiva. No entanto, os resultados da depleção da Cullin 3 sugerem que esta pode ser relevante para a infeção por Plasmodium, uma vez que a depleção da sua expressão por siRNA reduz a carga parasitária. Contudo, mais experiências serão necessárias para elucidar os mecanismos moleculares por detrás deste efeito. As experiências realizadas não demonstraram qualquer efeito significativo na acumulação de vesículas em torno do parasita. Estas observações podem ser explicadas pelo facto do papel exato da ubiquitinação mediada por Cullin 3 na via endocítica permanecer ainda desconhecido. Esta proteína pode estar envolvida em cada uma das etapas da maturação dos endossomas, que incluem, alterações morfológicas, troca de componentes de membrana, movimento do endossoma para a região perinuclear, e formação de intraluminal vesicles (ILVs). Assim, um melhor conhecimento dos intervenientes moleculares que afetam direta ou indiretamente os processos de maturação do endossoma será importante para esclarecer a interação entre o parasita e a célula hospedeira, e contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para controlar a infeção por malária na fase hepática.
Malaria is caused by Plasmodium parasites and transmitted by infected female Anopheles mosquitoes. There are two stages of malaria infection in mammals. The first stage occurs in the liver, where Plasmodium sporozoites invade and replicate extensively inside hepatocytes. This high multiplication rate imposes a significant demand of nutrients and therefore it is likely that Plasmodium has developed mechanisms to exploit the host cell resources. Recent studies established that interactions between Plasmodium berghei parasites and the host endocytic pathway are crucial for parasite growth during liver stage infection. Cullin 3 recently emerged as an important regulator of intracellular trafficking, in particular secretion and endosome maturation. Cullin 3 is specifically activated (neddylated) at the plasma membrane and is found associated with vesicular markers for intracellular trafficking. Additionally, depletion of Cullin 3 results in deformation of late endosomes and causes defects in the transport of endocytic cargo to lysosomes. Given the important association of host vesicles with Plasmodium parasites developing inside the hepatocyte and the role of Cullin 3 in endosome maturation, in this thesis, we proposed to characterized the role of Cullin 3 during Plasmodium intra-hepatic development using functional assays of gain- and loss- of function, namely by over-expressing Cullin 3 and blocking Cullin 3 signaling using a neddylation inhibitor MLN4924 or depleting Cullin 3, using siRNA. Although gain-of-function experiments and the treatment with neddylation inhibitor MLN4924 were inconclusive, our results showed that Cullin 3 is apparently relevant in the context of malaria infection. In fact, depletion of Cullin 3 expression by siRNA reduced Plasmodium levels in Huh7 cells, suggesting that Cullin 3 signaling is important during liver-stage infection. However, more studies are necessary to confirm this phenotype and elucidate the molecular mechanisms behind it.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15736
Designação: Biologia Molecular e Genética
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