Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15738
Título: Study of a conserved herpesvirus gene inducer of cell cycle arrest and IL-8
Autor: Dias, Diogo Bernardes, 1991-
Orientador: Caeiro, Filomena, 1950-
Nascimento, Rute
Palavras-chave: Herpes
Citomegalovírus
Expressão génica
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: O gene UL76 do citomegalovírus humano (HCMV) pertence a uma família de genes homólogos conservados em todos os herpesvírus, envolvidos na evasão aos mecanismos de defesa do hospedeiro, denominada família de genes UL24. Esta família é alvo de estudo devido ao facto de permanecer a única família de genes homólogos ao qual ainda não foi associada nenhuma função principal. No entanto, a sua conservação e simultânea falta de homologia com genes celulares indicam de que se trata de uma família com um papel determinante no ciclo de vida dos herpesvírus. O trabalho que tem sido feito em relação a esta família visa elucidar a comunidade científica quanto aos mecanismos empregues pelos herpesvírus para escapar à detecção pelo sistema imune do hospedeiro e estabelecer uma latência que se pode prolongar durante grande parte da vida desse mesmo hospedeiro. É esta capacidade que torna os herpesvírus nunm dos grupos de patogéneos mais prevalentes e eficientes da Humanidade. No que toca ao UL76, descobertas anteriores reportam que as principais funções associadas a este gene em particular incluem a capacidade de por si só ser capaz de induzir uma paragem no ciclo celular na transição entre a fase G2 e mitose (G2M), bem como um papel crucial na indução e manutenção da expressão da interleucina-8 (IL-8). Do ponto de vista do vírus, ambas estas acções são benéficas para o seu ciclo replicativo de vida. A paragem no ciclo celular permite à célula manter um microambiente membranar estruturado favorável à replicação viral, microambiente este que seria totalmente perdido se à célula fosse permitido entrar na fase mitótica. Enquanto esta última função beneficia a replicação do vírus, a indução de IL-8 actua ao nível da sua propagação já que esta interleucina específica é responsável pela quimioatracção de neutrófilos, os quais são infectados pelo vírus e utilizados na sua disseminação pelo hospedeiro. Enquanto a capacidade para induzir paragem no ciclo celular se encontra conservada em todos os genes da família UL24, a indução de IL-8 não se encontra propagada pelos homólogos desta mesma família. Contudo, ambas estas acções derivam da habilidade anteriormente demonstrada que o UL76 do HCMV tem de induzir danos no DNA, que levam a uma activação e resposta adequada por parte da via de DNA Damage Response. A activação da via previamente referida é dependente de ATM, uma cinase de serina/treonina que é activada por quebras em dupla cadeia no DNA, responsável pela transdução de um sinal que resulta na fosforilação de várias proteínas alvo que levam a várias respostas incluindo reparação do DNA e paragem no ciclo celular. A ATM inicia então uma via de sinalização em cascata que resulta na activação de p53, um regulador do ciclo celular responsável pela manutenção da integridade genómica. Este factor controla uma proteína denominada p21, que por sua vez regula várias etapas nas transições do ciclo celular. Após activação de p53 e consequente activação de p21, este último é translocado para o núcleo onde participa então na transcrição de genes responsáveis pela resposta adequada a danos no DNA, culminando estes eventos numa paragem G2M no ciclo celular. Para além disso, os dados no DNA causados pelo UL76 podem ainda ser reconhecidos pela via de sinalização NF-kB, a qual levará à indução da expressão de IL-8. NF-kB é um complexo proteico formado por factores de transcrição cuja via de sinalização participa em vários mecanismos de resposta a stress, como por exemplo respostas imunitárias e inflamatórias. Na ausência de estímulo este complexo proteico encontra-se inactivo pelas proteínas inibitórias IkB. Após estimulação ocorre fosforilação do complexo IKK e da proteína regulatória NEMO, que formam um complexo responsável pela posterior fosforilação das proteínas IkB que se tornam assim alvo de degradação. Deste modo o complexo NF-kB torna-se activo e desloca-se para o núcleo a fim de induzir a expressão de genes alvo. O UL76 actua através da via genotóxia do NF-kB, que resulta num sinal que leva à translocação de NEMO para o núcleo, onde é modificada e complexada com a ATM. Este complexo é exportado para o citoplasma e activa o complexo IKK que fosforila então a proteína inibitória IkB, libertando o complexo NF-kB que se dirige assim para o núcleo levando assim à indução da expressão de IL-8. Neste trabalho o meu papel foi o de determinar quais dos domínios do UL76 são responsáveis pelas funções previamente referidas, nomeadamente a indução de paragem celular em G2M e de IL-8, as principais funções associadas a este determinado gene. Estudos recentes detalham a presença de cinco domínios conservados em todos os herpesvírus localizados na região N-terminal de UL76, enquanto a região C-terminal demonstra ser altamente variável. Deste modo é possível verificar que o existe uma região N-terminal conservada e uma região C-terminal não-conservada, o que à partida se ajusta ao facto do UL76 possuir duas funções principais. Funções essas que são a capacidade de induzir paragem no ciclo celular na transição G2M, capacidade partilhada por todos os homólogos da família UL24, e a indução da expressão de IL-8, específica para o UL76 do cítomegalovírus humano. O meu trabalho começou então por utilizar enzimas de restrição de modo a obter duas metades do gene UL76, que codificam para a região N-terminal e para a região C-terminal da proteína. Ambos os mutantes de delecção foram clonados em vectores de expressão que foram posteriormente alvos de ensaios de expressão, nomeadamente western blots e ensaios de imunofluorescência de modo a averiguar se ambas as proteínas deletérias eram expressas e qual a sua localização celular. Após confirmação de expressão tanto da região N-terminal como da região C-terminal o próximo passo prendia-se com a determinação de qual das regiões, se alguma, era responsável pela indução de IL-8. De modo a estudar esta função recorreu-se a ensaios de luciferase para averiguar a actividade transcripcional do gene da luciferase sob o controlo do promotor de IL-8 e a ELISA para confirmar a presença da interleucina-8 em células transfectadas com os domínios previamente obtidos do UL76. Em ambos os ensaios foi possível concluir que a indução da expressão de IL-8 está apenas a cargo da região C-terminal não-conservada e não da região N-terminal conservada, o que tem lógica uma vez que esta função apenas está presente neste homólogo pertencente ao citomegalovírus humano. Finalmente, ambos os mutantes foram sub-clonados em vectores de expressão para produção em lentivírus, de modo a serem alvo de ensaios de ciclo celular para determinar se algum dos mutantes, ou até mesmo ambos, eram de facto capazes de induzir paragem de ciclo celular em G2. A análise do ciclo celular através de FACS leva à observação que a capacidade de induzir paragem em G2M no ciclo celular se encontra presente apenas na região N-terminal conservada e não na região C-terminal não-conservada. Mais uma vez, esta descoberta segue a lógica correcta uma vez que a indução de paragem do ciclo celular é uma característica presente em todos os homólogos da família de genes UL24 dos herpesvírus. Através dos resultados obtidos é possível concluir que neste trabalho se identificam as regiões onde as duas principais funções de UL76 se encontram codificadas, uma vez que os resultados demonstram claramente que a região N-terminal conservada é responsável pela paragem no ciclo celular em G2M, uma função conservada em todos os homólogos de UL24, enquanto a indução de IL-8 se encontra restrita na região variável C-terminal. Está então explicado desta maneira o porquê desta função particular se encontrar apenas no homólogo pertencente ao citomegalovírus humano.
The UL76 gene of the human cytomegalovirus belongs to the UL24 gene family, conserved in all herpesvirus. Previous work has demonstrated that UL76 induces a cell cycle arrest at G2/M, perhaps favouring virus replication, and also induces expression of IL-8, a cytokine known to enhance virus propagation. While the former function is conserved in all genes of the UL24 family, only the HCMV homologue UL76 induces expression of IL-8. Paradoxically, both the induction of cell cycle arrest and expression of IL-8 result from activation of the DNA Damage Response (DDR) pathway. Activation of the DDR is dependent on activation of ATM and the resulting signaling cascade that ends with the activation of p53, the translocation of p21 to the nucleus and the consequent transcription of target genes associated with the DDR, resulting in a cell cycle arrest. In addition, DNA damage by UL76 can also activate the NF-kB pathway, through the translocation of the NEMO-ATM complex, leading to activation of NF-kB and then transcription of IL-8.The obvious question that arises, and is addressed in this work, is whether both the cell cycle arrest and induction of IL-8 are controlled by the same or different domains of UL76. Recent studies reveal the presence of five conserved sequences localized in the N-terminal region of UL76, while the C-terminal region is highly variable within the UL24 family. Therefore, deletion mutants of the UL76 gene corresponding to the N-terminal and the C-terminal regions were constructed and cloned into expression vectors which were then the subject of expression and functional assays. Western blots and immunofluorescence assays confirmed that the predicted products were in fact expressed in transfected cells. The entire UL76 gene as well as the N-terminal and C-terminal regions deletion mutants were then tested for their impact on G2/M progression (cell cycle analysis through FACS inspection of propidium iodide labeled cells) and IL-8 expression (luciferase reporter assays and ELISAs for secreted IL-8). The results clearly show that the conserved N-terminal region is responsible for the cell cycle arrest at G2, an observation consistent with conservation of the N-terminal region homologous domains and the finding that all homologues of the UL24 family induced G2/M cell cycle arrest. In contrast, induction of IL-8 is restricted to the C-terminal variable region, thus explaining why this particular function is not conserved amongst all genes of the UL24 family.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15738
Designação: Mestrado em Biologia (Microbiologia Aplicada)
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