Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15747
Título: Digested raspberries polyphenols for brain health: attenuation of neuroinflammation
Autor: Garcia, Gonçalo Filipe Rodrigues, 1990-
Orientador: Caria, Maria Helena
Pinto, Maria Paula S. Ferreira da Silva Marinho, 1965-
Palavras-chave: Neuroinflamação
Polifenois
Microglia
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Microglia are the resident innate immune cells in the central nervous system (CNS), representing the first defense line of the neural parenchyma. However, its chronic activation is implicated in neurodegenerative disorders by the uncontrolled release of diverse molecular mediators such as inflammatory cytokines. Among all dietary phytochemicals, polyphenols are the major anti-inflammatory molecules provided by some plants. As example, raspberries are an enriched natural source of polyphenols such as ellagic acid, flavanols; and phenolic acids. However, digestion strongly modifies the structure of polyphenols, producing metabolites with different bioactivities. Thus, it is imperative the study of digested polyphenols for a better elucidation about their effects. The main goal of this study was to evaluate the bioactivity of raspberry polyphenols as neuroinflammatory attenuators. The fractions studied were composed by polyphenols that are bioaccessible to blood serum, obtained from in vitro digestion of five different quasi-isogenic raspberries. Furthermore, N9 murine microglial cell line was implemented as model of neuroinflammation and the range of non-cytotoxic concentrations of each fraction was determined. Then, the neuroinflammatory attenuation induced by each digested fraction in LPS-stimulated microglia was evaluated and compared. As result, some of the fractions attenuated microglial pro-inflammatory activation, significantly decreasing the expression of membrane protein CD-40 (marker of microglial activation) and the production of the pro-inflammatory markers, nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and intracellular superoxide (O2•-). Additionally, a yeast model of inflammation was used as a mechanistic tool to elucidate the molecular mechanisms underlying the anti-inflammatory activity of the digested raspberry fractions. The results showed that these compounds inhibit the yeast Crz1/calcineurin pathway, which is homologous to the mammalian nuclear factor of activated T-cells (NFAT)/calcineurin, suggesting that they may prevent microglial neuroinflammation through this pathway.
Quando exposto a diversas agressões tais como infeções, toxinas ou traumatismos, o sistema nervoso central medeia uma resposta inflamatória complexa e ao mesmo tempo dinâmica. Esta resposta inclui uma curta e eficiente ativação do sistema imunitário, que geralmente é mediada pela população de células imunitárias residentes – a microglia. A microglia representa cerca de 12% do tecido cerebral e participa na primeira linha de defesa do parênquima neural. Num estado não ativado apresenta uma morfologia ramificada, tendo como função a continua monitorização do espaço que rodeia os neurónios. Uma vez exposta a um estímulo pro-inflamatório, a microglia entra num estado ativado que, tipicamente, é acompanhado de uma transição da morfologia para uma forma ameboide, o que favorece a fagocitose. Neste estado, a expressão de muitos recetores de superfície relacionados com a resposta imunitária é aumentada. São também induzidas muitas vias de sinalização celular que conduzem à secreção de diferentes compostos pro-inflamatórios. Por exemplo, compostos como o fator de necrose tumoral – α (TNF-α), a interleucina - 1β (IL-1β), ou as espécies reativas de oxigénio, são regulados por diferentes vias de sinalização celular tais como a via do fator nuclear – κB (NF-κB), a via do fator nuclear das células T ativadas (NFAT) ou a vias das cinases MAP (MAPK). Muitos dos agentes pró-inflamatórios conhecidos e descritos são pesticidas como o paraquato, dieldrina, lindano ou rotenona; outros são toxinas como os lipopolissacarídeos (LPS) provenientes da membrana exterior de bactérias gram-negativas. Geralmente, estes agentes estão associados a casos patológicos, nos quais a microglia adquire um estado de sobreativação crónica. Nestes casos, muitos compostos mediadores da inflamação são continuamente e abundantemente secretados pela microglia, causando lesões e prococando ativação das vias de apoptose nas células neuronais vizinhas. Elevados e contínuos níveis de produção de óxido nítrico, de espécies reativas de oxigénio e de citocinas estão descritos como patológicos em várias doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerose Múltipla ou Esclerose lateral amiotrófica. Por sua vez, proteínas como a α-sinucleína ou a β-amilóide, que estão descritas nas doenças de Parkinson e Alzheimer, respetivamente, atuam como agentes pro-inflamatórios, perpetuando e intensificando a resposta inflamatória. Nos casos mais severos, ocorre uma fragilização da barreira hematoencefálica, o que permite a entrada de macrófagos periféricos para a progressão e intensificação do processo inflamatório. Os hábitos alimentares atuais também promovem uma ação pró-inflamatória que contribui para a progressão de algumas das doenças crónicas anteriormente citadas. A dieta atual envolve o elevado consumo de carnes vermelhas, doces, alimentos ricos em gorduras e bebidas gaseificadas, enquanto há um baixo consumo de fruta fresca, nozes, vegetais, cereais e fontes naturais de ómega-3 como o peixe. Muitos estudos com vista à atenuação da neuroinflamação comprovaram que a dieta, e em especial, o consumo de algumas classes de polifenóis provenientes da fruta e dos vegetais, parece ter um efeito positivo nesse contexto. No entanto, é importante mimetizar os diversos processos de transformação que ocorrem nos polifenóis durante a digestão in vivo, uma vez que essas transformações alteram drasticamente a sua função biológica. Uma das formas de mimetizar a digestão é o recurso à utilização de modelos de digestão in vitro, a partir dos quais se obtêm as frações digeridas dos polifenóis. Os metabolitos constituintes destas frações são semelhantes àqueles que estariam bioacessíveis às células alvo in vivo. A procura de polifenóis cujos efeitos sejam benéficos face às mais diversas patologias, como o cancro ou as doenças neurodegenerativas, levou ao aumento do estudo dos pequenos frutos. Estes frutos possuem uma vasta gama e um elevado teor em polifenóis, o que propicia a sua utilização na investigação científica. Em particular, as espécies do género Rubus têm sido referenciadas como altamente benéficas para a saúde. No presente estudo, avaliou-se a eventual atenuação da neuroinflamação promovida por cinco frações digeridas de diferentes framboesas em células de microglia. As cinco cultivares de framboesa utilizadas provêm de um banco de germoplasma do James Hutton Institute, caracterizando-se por diferirem entre si na constituição nas diferentes classes de polifenóis. Para a obtenção das frações digeridas, as diferentes framboesas quasi-isogénicas foram liofilizadas, solubilizadas em água e submetidas a um modelo de digestão in vitro. De cada tipo de framboesa resultaram duas frações distintas, uma fração digerida bioacessível ao cólon e uma fração digerida bioacessível ao soro do sangue. Para o presente trabalho apenas foram utilizadas as frações bioacessíveis ao soro do sangue. Todo o processo da digestão in vitro até à obtenção das frações foi desenvolvido pelo Dr. Derek Stewart, do James Hutton Institute. A primeira tarefa deste trabalho foi a implementação do modelo de neuroinflamação com a linha celular N9 de microglia de ratinho. Para tal, as células foram estabelecidas em cultura in vitro e estimuladas com LPS. Devido à complexidade inerente à resposta inflamatória mediada pela microglia, foi necessário identificar e aceder a diferentes marcadores pró-inflamatórios típicos da microglia ativada, através de diferentes técnicas. Para a determinação do óxido nítrico libertado pelas células, foi quantificado o teor em nitritos no meio de cultura através da reação de Griess. O fator de necrose tumoral – α (TNF-α) foi quantificado no meio de cultura, recorrendo à técnica de Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) quantitativa. O radical superóxido e a proteína de membrana CD-40 foram ambos quantificados recorrendo à técnica de citometria de fluxo. A tarefa seguinte foi a avaliação da citotoxicidade das frações de framboesa digerida, como forma de determinar, dentro da gama de concentrações descritas como fisiológicas, quais as concentrações não toxicas adequadas para a sua utilização na linha celular N9 de microglia de ratinho. A última tarefa foi a avaliação da atenuação da neuroinflamação promovida pelas frações digeridas na linha celular N9 de microglia de ratinho. Para tal, as células foram pré-incubadas com as diferentes frações digeridas de framboesa e seguidamente estimuladas com LPS. De seguida, foram quantificados os diferentes marcadores previamente validados na primeira tarefa (óxido nítrico, TNF-α, CD-40 e radical superóxido). Como resultado, três das frações digeridas revelaram grande consistência na significativa redução da produção e expressão dos diversos marcadores na linha de microglia N9, o que evidência o seu forte contributo para a atenuação da neuroinflamação. Por outro lado, as restantes duas frações não exibiram um efeito anti-inflamatório consistente para todos os marcadores inflamatórios, sendo que em alguns desses marcadores não se observaram reduções significativas na produção/expressão relativamente aos controlos positivos da inflamação. Adicionalmente, como ferramenta mecanística foi utilizado um modelo de inflamação construído em levedura. A utilização deste modelo revelou que, de alguma forma, os metabolitos presentes nas frações de framboesa digerida interferem na regulação da via celular calcineurina / Crz1, reprimindo a sua indução pelo dicatião cálcio (Ca2+). Esta via de sinalização é regulada de uma forma semelhante nos mamíferos, sendo que CRZ1 é ortólogo de NFAT, que, por sua vez, está intrinsecamente relacionado com a inflamação. Assim, os resultados obtidos com o modelo de inflamação em levedura sugerem que uma das vias pela qual os metabolitos presentes nas frações digeridas de framboesa atenuam a neuroinflamação na microglia é pela via da calcineurina - NFAT. Por último, os resultados da atenuação da inflamação na microglia e nos ensaios em levedura foram comparados com as diferentes composições químicas em polifenóis de cada uma das frações digeridas utilizadas. Por conseguinte, algumas classes de polifenóis, tais como os conjugados de ácido elágico, foram identificadas como relacionadas com o poder anti-inflamatório das frações.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15747
Designação: Mestrado em Biologia Molecular e Genética
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