Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15748
Título: Study of a new pathway involved in electron bifurcation in araerobic bacteria
Autor: Oliveira, Gonçalo Pizarro Madureira Salgado de, 1991-
Orientador: Pereira, Inês Cardoso
Venceslau, Sofia
Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-
Palavras-chave: Bioenergia
Bactérias anaeróbicas
Expressão génica
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Bioenergetics of chemotrophic bacteria is based on substrate-level phosphorylation and electron transfer phosphorylation for energy conservation. Recently, a third mechanism of energy coupling named flavin-based electron bifurcation (FBEB) was proposed for anaerobic bacteria. Sulfate-reducing organisms (SRO) are a polyphyletic group of anaerobic microorganisms, which perform dissimilatory sulfate reduction. Interestingly, studies concerning SRO identified protein homologies to enzymes engaged in FBEB in methanogens, suggesting the presence of FBEB in sulfate reducers. Here we studied: i) the physiological role of a protein complex (HdrABC-FloxABCD) possibly involved in FBEB; and ii) the function of DsrD, a protein potentially involved in sulfite reduction, the last step of the dissimilatory sulfate reduction. Firstly, phenotypic characterization of hdrC and floxA mutants in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough with ethanol as electron donor revealed no cell growth, while a complemented strain of the floxA mutant grew similarly to the wild-type (WT). Then, under pyruvate fermentation conditions, both mutants produced low levels of ethanol comparing to the WT and complemented strain. Gene and protein expression analysis in WT strains cultured with different electron donors/acceptors showed upregulation of FloxA and HdrA when ethanol is the electron donor. Moreover, an alcohol dehydrogenase (adh1) gene present upstream of the hdr-flox cluster is also upregulated in the medium containing ethanol. Altogether, these results show that the HdrABC-FloxABCD complex is involved in the ethanol metabolism of D. vulgaris. Secondly, the dsrD gene from D. vulgaris was cloned, overexpressed and the protein purified. Sulfite reduction activity and protein-protein interaction studies showed no direct biochemical role of DsrD in sulfite reduction. Then a dsrD deletion mutant was generated showing a long lag phase under sulfate reduction conditions when compared to the WT. This mutant did not grow with sulfite as electron acceptor, revealing the importance of dsrD in sulfite reduction, most likely at a regulatory level. Overall, this work allowed a better understanding of energy conservation mechanisms in SRO, proposing a new mechanism for ethanol metabolism played by the FloxABCD-HdrABC complex and producing new insights into the function of DsrD in the dissimilatory sulfate reduction.
Os sistemas bioenergéticos de bactérias quimiotróficas baseiam-se em dois mecanismos de conservação de energia: a fosforilação ao nível do substrato (FNS) e a fosforilação oxidativa (FO). A FO é também conhecida como respiração e envolve acoplamento quimiosmótico. Recentemente, um outro mecanismo de acoplamento energético, chamado bifurcação electrónica baseada em flavinas (BEBF), foi proposto para bactérias anaeróbias quimiotróficas. Este mecanismo é caracterizado por acoplar uma reacção termodinamicamente não favorável a uma reacção favorável e foi já experimentalmente demonstrado em organismos fermentativos, árqueas metanogénicas e bactérias acetogénicas. Os complexos proteicos envolvidos na BEBF são citoplasmáticos, contêm flavinas como cofactores (FMN ou FAD) e um dos aceitadores/dadores de electrões é normalmente uma ferredoxina (Fd). Os organismos redutores de sulfato (ORS) são um grupo polifilético de microrganismos existentes em ambientes anaeróbios, tendo um metabolismo versátil. Os sulfato-redutores têm a capacidade de realizar a redução dissimilativa do sulfato, i.e., de reduzir grandes quantidades de sulfato como mecanismo de conservação de energia produzindo sulfureto, um produto tóxico do seu metabolismo. Deste modo estes organismos contribuem para o ciclo biogeoquímico do enxofre usando o sulfato como aceitador de electrões durante a degradação de matéria orgânica, produzindo sulfureto que pode ser oxidado por outros microrganismos. Pela capacidade que têm de utilizar diversos dadores e aceitadores de electrões, os ORS são usados em bio-remediação de metais tóxicos e compostos orgânicos como hidrocarbonetos; todavia estes organismos comportam igualmente um impacto negativo, nomeadamente contribuindo para a bio-corrosão de metais ferrosos e de betão e contribuindo ainda para a acidificação de reservas de petróleo. Apesar da importância ambiental destes microrganismos, os mecanismos de conservação de energia neste grupo permanecem por conhecer com clareza. Para estudos fisiológicos, genéticos e bioquímicos é normalmente utilizado o organismo modelo Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, uma vez que é relativamente fácil e rápido de cultivar em laboratório, tendo sido o primeiro ORS a ter o seu genoma sequenciado. Estudos genómicos identificaram proteínas semelhantes à heterodilsulfureto redutases (Hdr) em ORS, especialmente proteínas homólogas à HdrA, a subunidade proteica que contém uma flavina como co-factor e que foi proposta ser responsável pela BEBF em árqueas metanogénicas. Este estudo sugere desta forma que o mecanismo de BEBF pode estar presente em procariotas sulfato-redutores. Assim sendo, o objectivo deste trabalho centra-se em contribuir para um maior e mais profundo conhecimento dos mecanismos de conservação de energia em sulfato-redutores, estudando o papel fisiológico do complexo citoplasmático heterodisulfureto redutase-oxidase de flavina (HdrABC-FloxABCD), que se pensa estar envolvido em BEBF, e investigando a potencial função da proteína redutase dissimilativa de sulfito (DsrD) na via da redução dissimilativa do sulfato. Na primeira parte do trabalho experimental, estudou-se o papel fisiológico dos genes flox-hdr em D. vulgaris Hildenborough, usando duas estirpes mutantes: IPFG01, com uma cassete de resistência a canamicina inserida no gene hdrC, e IPFG02, uma estirpe em que o gene floxA foi substituído por uma cassete de resistência a canamicina por recombinação homóloga. A caracterização fenotípica das estirpes mutantes revelou que ambos os mutantes são incapazes de crescer quando o etanol é usado como dador de electrões para reduzir sulfato. Por outro lado uma estirpe mutante complementada com o gene floxA (IPFG03) cresceu de forma semelhante ao WT. Durante o crescimento fermentativo em piruvato, realizou-se a quantificação da concentração de etanol no meio extracelular através de um método enzimático. Este ensaio experimental revelou uma produção muito baixa de etanol por parte das estirpes mutantes IPFG01 e IPFG02, comparativamente às estirpes WT e IPFG03, indicando deste modo que em condições fermentativas de crescimento, as proteínas FloxABCD estão envolvidas na redução de NAD+ para produção de etanol. Foram adicionalmente realizados estudos de expressão génica ao nível do gene (por PCR quantitativo) e da proteína (por “Western blotting”) na estirpe selvagem (WT) em condições de cultura contendo diferentes dadores e aceitadores de electrões. Estes revelaram que os genes floxA e hdrA são sobre-expressos quando é usado etanol como dador de electrões, e o mesmo foi observado ao nível da expressão proteica. A montante dos genes hdr-flox está situado um gene que codifica para uma álcool desidrogenase (adh1) revelando igualmente uma sobre-expressão quando o etanol é usado como dador de electrões. Contudo a expressão do gene adh1 é consideravelmente superior à dos genes anteriormente referidos, indicando que os genes adh1 e hdr-flox não se encontram no mesmo operão. Esta diferença observada ao nível da expressão génica reflectiu-se na purificação das proteínas: enquanto que a proteína Adh1 foi facilmente purificada, o mesmo sucesso não foi obtido na purificação das proteínas Flox e Hdr devido à sua baixa expressão. Os resultados obtidos considerando esta parte do trabalho demonstram que as proteínas FloxABCD estão envolvidas no metabolismo do etanol em D. vulgaris. Propomos então que o complexo FloxABC-HdrABCD seja capaz de realizar BEBF acoplando a redução de Fd com NADH à redução da proteína DsrC igualmente com NADH. Na segunda parte deste trabalho, o gene dsrD foi clonado, sobre-expresso em Escherichia coli e a proteína subsequentemente purificada por técnicas cromatográficas. O gene dsrD encontra-se situado imediatamente a jusante do gene dsrAB, fazendo ambos parte do mesmo operão. A redutase dissimilativa de sulfito (DsrAB) é, juntamente com a proteína DsrC, responsável pelo último passo da redução dissimilativa do sulfato. Tendo em conta a potencial importância da proteína DsrD na redução do sulfato, foram realizadas ensaios espectrofotométricos de actividade enzimática de redução do sulfito e testes de interação proteína-proteína (por Biacore) e proteína-ligando (por Calorimetria de Titulação Isotérmica) de modo a detectar interações entre a DsrD e DsrAB, DsrC e/ou sulfito. Apesar das diversas tentativas, não foram obtidos resultados positivos, levando-nos a crer que a proteína DsrD desempenha um papel regulatório em vez de um papel funcional directo na redução do sulfato. Um vez que a estrutura tridimensional da proteína foi já obtida e inclui um domínio de ligação ao DNA, considera-se que a proteína DsrD desempenhe um papel regulatório in vivo. Durante este trabalho experimental foi construído um mutante de deleção por troca da sequência codificante para o gene dsrD com uma cassete de resistência a canamicina através de recombinação homóloga. Os estudos fenotípicos com esta nova estirpe revelaram uma longa fase de adaptação na curva de crescimento em meio de cultura contendo sulfato como aceitador de electrões, comparativamente com a estirpe WT. Pensamos que após a longa fase de adaptação as células adquirem espontaneamente mutações que lhes permitem adaptar-se ao meio contendo sulfato, demonstrando que o gene dsrD pode estar a regular os genes dsrAB afectando deste modo a via respiratória. Adicionalmente, a estirpe mutante não foi capaz de crescer em meio com sulfito como aceitador de electrões, o que revela que este gene é essencial para a redução do sulfito. De uma forma geral, este trabalho contribuiu para uma melhor e mais profunda compreensão do modo como os organismos sulfato-redutores desempenham a conservação de energia, com especial interesse na nova via de conservação de energia, BEBF, que aparenta estar disseminada pelas bactérias quimiotróficas anaeróbias. Em perspectivas futuras seria ideal conseguir expressar e purificar o complexo FloxABCD-HdrABC de modo a analisar a BEBF in vitro. Adicionalmente, novas indicações foram obtidas no que toca a compreender qual a função ao nível fisiológico da proteína DsrD, envolvida na redução dissimilativa do sulfato. Em continuação deste projecto, seria interessante determinar a capacidade de interação da proteína DsrD com o DNA in vitro, analisar que genes substituem a função do gene dsrD, permitindo a adaptação da estirpe mutante ao meio de cultura contendo sulfato como aceitador de electrões, e ainda qual a contribuição desses mesmos genes para a via da redução dissimitativa do sulfato.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15748
Designação: Biologia (Microbiologia Aplicada)
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