Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15750
Título: Validation of neuroprotective effect of blackberries digested metabolites in a model of neurodegeneration based on mice neurons primary culture
Autor: Costa, Inês de Sousa
Orientador: Tavares, Lucélia Rodrigues
Gomes, Artur Paiva Loureiro
Palavras-chave: Doenças neurodegenerativas
Polifenóis
Mitocôndria
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Neurodegenerative diseases represent a large and heterogeneous group of neurological disorders with increasing incidence associated with aging. Oxidative stress and glutamate excitotoxicity are thought to be one of the main contributing factors to neurodegeneration. The ingestion of fruits and vegetables have been associated to a decreased risk of neurodegenerative and cardiac diseases amongst others, which justifies the increased interest for the preventive properties of (poly)phenols from berry fruits. Thus, the aim of this work was to validate the neuroprotective effect of blackberries digested metabolites in a model of neurodegeneration based on mice neurons primary culture. Establishment of cerebellar granule cells in culture was performed from 7 day-old mice. Initially, an optimization of some media components was performed and integrity and functionality of primary neurons was confirmed. To mimic neurodegeneration, glutamate was chosen as the chemical stimulus under 90 μM, as it has given the ideal percentage of death to allow cell response to digested extracts. In order to evaluate the neuroprotective effect of blackberries digested metabolites, different concentrations, close to the physiological range concentrations of phenolic compounds detected in human plasma, were tested, and as no toxic effects were detected, concentrations from 0.25-1 μg GAE mL-1 were chosen for further cytoprotective assays. Significantly similar neuroprotective effects were obtained for the three concentrations tested when compared to cells exposed only to glutamate. Mitochondrial electron transport chain complexes were analyzed at protein level through western blot. Preliminary analysis at DNA level for further quantitative PCR was also initiated. In conclusion, this work allowed the establishment of primary cultures of cerebellar granule cells and the validation of blackberries digested metabolites neuroprotective effect. It was attempted mitochondrial complexes I, II and IV as the most affected under glutamate induced excitotoxicity, with a partial recovery of complex IV incubations with digested extract.
As doenças neurodegenerativas, como são exemplo as doenças de Alzheimer, Parkinson, Huntington e Esclerose Lateral Amiotrófica, representam um amplo e diversificado grupo de distúrbios neurológicos com características clínicas e patológicas bastante heterogéneas. Esta diversidade é resultado do envolvimento de subconjuntos específicos de neurónios presentes em sistemas funcionais também eles específicos. O stress oxidativo tem sido descrito como um importante fator que condiciona o envelhecimento e as alterações cognitivas associadas a este tipo de doenças, podendo ser provocado por várias razões, incluindo a acumulação de glutamato extracelular. As células neuronais são altamente vulneráveis ao stress oxidativo não só devido às suas necessidades energéticas elevadas e ao elevado consumo de oxigénio, mas também por outro lado por apresentarem baixos níveis de antioxidantes endógenos, o que justifica a necessidade de sistemas biológicos de defesa (antioxidante) capazes de manter o balanço fisiológico relativamente à formação/eliminação das espécies reativas de oxigénio/azoto (ROS/RNS). O glutamato é o neurotransmissor endógeno mais predominante no cérebro humano, sendo as suas respostas mediadas por dois tipos de recetores pós-sinápticos: os ionotrópicos (N-metil-d-aspartato (NMDA), ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA), cainato) e os metabotrópicos. A acumulação excessiva de glutamato extracelular na fenda sináptica por um período prolongado de tempo, que tem por consequência danos neuronais e morte celular, refere-se ao processo designado por excitotoxicidade. A mitocôndria representa um dos organelos mais críticos para a sobrevivência da célula, pois apresenta o maior consumo de oxigénio celular, contém DNA próprio e sofre alterações contínuas através dos processos de fissão e fusão consoante as necessidades/condições energéticas da célula. A fosforilação oxidativa, processo através do qual a célula consegue produzir energia, ocorre através de cinco complexos multiproteicos e dois transportadores de eletrões que constituem a cadeia transportadora de eletrões. Esta constitui a maior fonte de ROS, que a par das anomalias mitocondriais representam fatores de grande importância no processo de envelhecimento e patogénese das doenças neurodegenerativas. A manutenção das faculdades cognitivas, que por sua vez é sinónimo de qualidade de vida, é influenciada por inúmeros fatores, sendo a nutrição um dos principais. Nesse sentido, os (poli)fenóis são moléculas que têm vindo a ser bastante investigadas nesta área. Estruturalmente estes contêm um ou mais anéis de benzeno, aos quais pelo menos um grupo hidroxilo está ligado, estando essencialmente presentes em frutas, vegetais, bebidas e algumas ervas, para as quais contribuem ao nível da cor, sabor e aroma. O seu consumo tem sido associado a uma diminuição do risco de doenças degenerativas em geral, de foro neurológico mas também doenças como o cancro, diabetes, osteoporose e doenças cardíacas, já que as inúmeras propriedades às quais os (poli)fenóis estão associados vão desde anti-inflamatórias e antioxidantes, até antialérgicas, antivirais, anti proliferativas, anti carcinogénicas e neuroprotetoras. No que diz respeito aos (poli)fenóis presentes em pequenos frutos, estes são reconhecidos pela sua atividade química antioxidante e efeitos neuroprotetores. Nesse sentido, este trabalho teve como principal objetivo a validação do efeito neuroprotetor de metabolitos de amoras digeridas num modelo de neurodegeneração estabelecido a partir de culturas primárias de neurónios de ratinho. A abordagem utilizada contempla o estudo destes compostos após sofrerem uma digestão in vitro. Este processo pretende simular as alterações bioquímicas e físico-químicas que ocorrem no trato gastro intestinal superior, permitindo assim uma extrapolação dos metabolitos bioacessíveis ao organismo. No que respeita às amoras, estas são conhecidas por representarem uma rica fonte de (poli)fenóis e a sua popularidade a nível alimentar tem vindo a aumentar, sendo já vários os benefícios documentados resultantes da ingestão deste fruto. No entanto, têm vindo a ser realizadas várias abordagens para análise destes efeitos: in vivo / in vitro; extrato total / extrato digerido; linhas celulares / células primárias, sendo que nem todos os resultados obtidos apresentam o mesmo significado biológico para a nutrição humana e neuroprotecção. A cultura de células representa uma ferramenta importante para o estudo das respostas celulares sob condições controladas e quando comparadas entre si, as culturas primárias e linhas celulares divergem em bastantes características, fazendo ressaltar a relevância da utilização de culturas primárias. Estas mimetizam o estado fisiológico das células in vivo, o que por sua vez permite a obtenção de dados mais relevantes no que diz respeito aos sistemas vivos. Os neurónios granulares constituem a maior população neuronal do cérebro de mamíferos, sendo por isso frequentemente utilizados como modelos para diferentes estudos. Para além disso, as células cerebelares granulares in vitro desenvolvem as características observadas nas mesmas células maduras in vivo. Por estas razões, as células cerebelares granulares foram adotadas neste estudo. Neste trabalho, o estabelecimento de culturas de células cerebelares granulares foi realizado a partir de ratinhos com 7 dias, sendo todas as experiências iniciadas ao 7º dia das células em cultura. Inicialmente, procedeu-se à otimização de alguns dos componentes do meio, nos quais o suplemento B-27 foi testado relativamente à sua composição em moléculas antioxidantes. Após a monitorização diária a nível morfológico (através de microscopia ótica) e a nível da viabilidade celular (através de microscopia de fluorescência por utilização das sondas de iodeto de propídeo e hoechst) durante 11 dias em cultura, a integridade e funcionalidade das células primárias foi confirmada por imunofluorescência através da utilização dos anticorpos para a tirosina hidroxilase e βIII-tubulina. Com o objetivo de mimetizar uma condição de neurodegeneração, em que os neurónios se apresentassem debilitados, o neurotransmissor glutamato foi selecionado como o estímulo químico a introduzir nas células, sendo que após diferentes concentrações serem testadas, se considerou que 90 μM induziam uma percentagem de morte que permitiria detetar uma resposta celular aos extratos anteriormente adicionados. Em seguida, e tendo como finalidade avaliar o efeito neuroprotetor dos metabolitos de amora após sofrerem digestão in vitro, diferentes concentrações de extrato compreendidas entre 0 e 1 μg GAE mL-1 foram testadas, concentrações essas que se encontram próximas do intervalo de concentrações fisiológicas definidas para compostos fenólicos no plasma humano. Tendo em conta que não foram observadas diferenças significativas entre as diferentes concentrações, nem quaisquer efeitos tóxicos paras as células decorrentes das mesmas, foram selecionadas para os estudos subsequentes as concentrações de 0.25, 0.5 e 1 μg GAE mL-1. Uma vez testados os extratos digeridos, foram observados resultados de neuroprotecção significativos e semelhantes para as 3 concentrações testadas, quando comparadas com as células expostas apenas ao estímulo tóxico (90 μM glutamato). Numa análise posterior, embora preliminar, foram analisados os complexos mitocondriais da cadeia transportadora de eletrões a nível proteico através da técnica de “western blot”, utilizando uma mistura de anticorpos para os 5 complexos da cadeia de fosforilação oxidativa. Os resultados obtidos permitiram sugerir um maior envolvimento dos complexos I, II e IV em situações de stress relativamente aos restantes. De forma a inferir sobre a possível biogénese mitocondrial, foi iniciado um estudo acerca do número diferencial de cópias de DNA mitocondrial para as diferentes condições testadas. Foram realizados testes preliminares de extração de DNA, quantificação, avaliação da qualidade do mesmo e amplificação por PCR, no qual os primers a serem utilizados foram testados, para posterior aplicação na reação de PCR quantitativo. Em conclusão, este trabalho permitiu em primeira instância a aquisição do conhecimento necessário ao estabelecimento de culturas primárias de células cerebelares granulares, o estabelecimento de um modelo de neurodegeneração a partir da aplicação de 90 μM de glutamato às células cerebelares granulares em cultura, e a validação do efeito neuroprotetor de diferentes concentrações (0.25, 0.5 e 1 μg GAE mL-1) de metabolitos de amoras digeridas, anteriormente verificado num modelo de neurodegeneração em linha celular (SK-N-MC) estabelecido através da aplicação de 300 μM de peróxido de hidrogénio. Para além disso, a análise de proteómica mitocondrial sugeriu a possibilidade de os complexos I, II e IV serem os mais afetados numa situação de stress, havendo uma parcial recuperação do complexo IV na presença dos extratos de amora. No que diz respeito à análise ao DNA, algumas condições inerentes à reação de PCR necessitam ainda de ser otimizadas previamente à execução de PCR quantitativo.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15750
Designação: Biologia (Biologia Molecular e Genética)
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