Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15752
Título: Role of Myc and CD8 T cells in γ-herpesvirus induced lymphoproliferation
Autor: Basto, Inês Marques, 1988-
Orientador: Simas, João Pedro, 1965-
Caeiro, Filomena, 1950-
Palavras-chave: Herpesvirus
Expressão génica
Proliferação de células
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: O herpesvírus murídeo do tipo 4, MuHV-4, é um gama-herpesvirus capaz de estabelecer infecções latentes em tecidos linfóides. Tal como outros herpesvírus, o MuHV-4 possui duas fases de expressão génica - a lítica e a latente – o que lhe permite estabelecer infecções crónicas durante toda a vida do hospedeiro. Durante a latência, o genoma de MuHV-4 persiste no núcleo de células latentemente infectadas sob a forma de epissoma, não havendo produção de viriões. MuHV-4 estabelece latência maioritariamente em células B que se encontram em proliferação em centros germinais, que por sua vez dão acesso às células B de memória de longa duração. Durante a infecção latente, o MuHV-4 expressa a proteína mLANA que se liga aos elementos repetitivos do genoma do vírus e aos cromossomas mitóticos do hospedeiro, permitindo a segregação do epissoma em células em divisão. Além do seu papel fundamental na manutenção do epissoma viral, mLANA é também uma proteína reguladora da transcrição, modulando substratos celulares, tais como NF-kB e MYC, sendo este último necessário para o desenvolvimento e manutenção de centros germinais. O mecanismo envolve a formação do complexo de ligase de ubiquitina EC5S mediado por um motivo SOCS-box-like presente em mLANA. O complexo EC5SmLANA interage com RelA, um dos membros da família NF-kB, promovendo a sua poli-ubiquitinação e consequente degradação pelo proteossoma. O complexo EC5SmLANA também promove a poli-ubiquitinação de MYC mas contrariamente ao que acontece com NF-kB que é degradado, MYC é estabilizado durante o ciclo celular, levando a uma linfoproliferação. Deste modo, mLANA tem efeitos antagónicos sobre os dois factores de transcrição - inibe a actividade transcricional de NF-Kb mas activa a actividade transcricional de MYC. Portanto, ao sequestrar o controlo pós- transcricional de MYC, mLANA aumenta o número de células B infectadas nos centros germinais. Numa tentativa, por parte de investigadores do nosso laboratório, para localizar a região de mLANA responsável pela interacção com os alvos, foi construída uma série de mutantes com delecções ao longo de mLANA. Embora o mapeamento tenha sido inconclusivo, o mutante D2 demonstrou aumentar a actividade E3 ligase de ubiquitina de mLANA resultando na estabilização de MYC e degradação proteossomal de NF-kB. Em consequência do resultado supramencionado, o objectivo deste projecto foi definido: investigar o papel oncogénico da modulação de MYC durante a infecção por gamma-herpesvirus. Para tal, dois vírus MuHV-4 recombinantes foram construídos, vD2 com uma delecção (Δ11-20) em mLANA que aumenta o efeito modulatório sobre MYC e vD2L92A que combina a mutação anterior com uma mutação em M2, uma proteína que se localiza predominantemente no citoplasma e membrana celular de células infectadas, e que possui um epítopo de células T restrito a H2-kd que, sabe-se que induz uma linfoproliferação persistente em centros germinais. A construção dos vírus recombinantes foi feita através da mutagénese de BAC. Esta técnica permite a manutenção do genoma viral como BAC em E. coli e mutagénese do genoma através de recombinação homóloga. A confirmação da integridade das mutações em mLANA foi feita através de sequenciação ao longo da região mutada. A estabilidade do genoma viral clonado como plasmídeo BAC foi confirmada por digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI e os seus perfis de restrição foram comparados com os do MuHV-4 BAC. Após a identificação de BACs recombinantes, reconstruíram-se os vírus recombinantes em BHK-21 com posterior passagem por células NIH Cre 3T3 de forma a extrair as sequências BAC. Foi demonstrado que estas últimas sequências podem atenuar o crescimento dos vírus in vivo. Para a produção de stocks virais, infectaram-se células BHK-21 com uma multiplicidade de infecção baixa de forma a não se produzirem vírus defectivos e os seus títulos foram determinados através de um ensaio de suspensão. Este ensaio consiste em diluições seriadas das suspensões virais com posterior adição de um número conhecido de células permissivas, células BHK-21. Após um período de incubação de 4 dias os títulos são calculados através da contagem de unidades formadoras de placas e tendo em conta o número de células permissivas adicionado. Seguidamente foi avaliada a cinética da replicação viral dos vírus recombinantes através de curvas de crescimento multistep. Ambos os vírus demonstraram uma cinética semelhante à do vírus MuHV-4, demonstrando que as mutações introduzidas não afectaram a replicação lítica in vitro. Os efeitos na fase latente de infecção das mutações introduzidas foram testados com um ensaio de reactivação ex vivo, em que ratinhos BALB/c foram infectados intranasalmente com MuHV-4 e as versões recombinantes. O ensaio consiste numa co-cultura de suspensões unicelulares provenientes de baços de animais infectados com fibroblastos permissíveis. A presença de vírus latentes na população inicial de esplenócitos resulta num efeito citopático nas camadas de fibroblastos e, a não ser que vírus infecciosos estejam presentes na altura da recolha dos baços, o efeito citopático é somente resultado da reactivação de vírus latentes. A capacidade de estabelecer e expandir uma infecção latente no baço foi avaliada aos dias 14, 21 e 50 pós-infecção. Tanto vD2 como vD2L92A demonstraram um severo deficit no estabelecimento e manutenção de uma infecção latente. Enquanto animais infectados com o vírus D2 ainda exibiram uma dose latente baixa, com vírus latentes um pouco acima do limite de detecção, os vírus latentes D2L92A estiveram sempre abaixo do nível de detecção. A proteína mLANA possui um sinal de localização nuclear putativo e, embora a mutação mLANA-D2 não tenho sido nesse local, pode ter modificado a estrutura da proteína e impedido a sua localização nuclear. Para tal, realizou-se uma imunofluorescência em células A20 transfectadas com plasmídeos mLANA-D2-GFP. Os resultados demonstraram que mLANA-D2 localiza-se no núcleo em células transfectadas. A capacidade de expressão dos mutantes de mLANA também foi avaliada, através de experiências de immunoblotting. Para tal infectaram-se células BHK-21 com o vírus WT e as versões recombinantes e os resultados revelaram que ambos os vírus, vD2 e vD2L92A expressavam mLANA equivalentemente e que o fenótipo do ensaio de reactivação ex vivo não foi devido à falta da expressão da proteína viral. O facto de os vírus recombinantes de MuHV-4 não conseguirem estabelecer e manter uma infecção latente, demonstra que as mutações introduzidas não são ideais para induzir linfoproliferação em centros germinais e desse modo obter um modelo de estudo para o desenvolvimento de alvos terapêuticos para doenças associadas a gamma-herpesvirus. Assim, é necessário desenvolver novas estratégias para a construção de vírus recombinantes capazes de manter uma infecção latente persistente. Contudo, também seria interessante desenvolver estratégias de forma a descortinar a razão pela qual ambos os vírus recombinantes demonstraram um défice muito acentuado no estabelecimento e manutenção da latência. A razão pode ser devida à incapacidade da mLANA mutada em manter o seu papel putativo na manutenção do epissoma. A resolução deste problema pode contribuir grandemente para actuar sobre doenças crónicas causadas por gamma-herpesvirus.
Murid herpesvirus-4 (MuHV-4) is a gamma-2-herpesvirus capable of establishing latent infections in lymphoid tissues. During latency, MuHV-4 expresses mLANA, which mediates episome persistence, tethering viral genome to mitotic host chromosomes. Moreover, mLANA has been implicated in the modulation of the cellular transcription factors NF-kB and MYC by assembling and EC5CmLANA ubiquitin-ligase complex. EC5CmLANA targets NF-kB family member RelA for poly-ubiquitination and subsequent proteosomal degradation. EC5CmLANA also mediates MYC poly-ubiquitination but this leads to its turnover and stability. Thus, mLANA by increasing MYC stability through the cell cycle, subsequently potentiates lymphoproliferation and disease. The aim of this project was to investigate the oncogenic role of MYC modulation during gammaherpesvirus infection. To this end, two recombinant MuHV-4 viruses were constructed: vD2 with mutations in mLANA that increase the modulation effect on MYC, and vD2L92A combining the previous mutation with a mutation in H2- kd-restricted T cell epitope which induce persistent lymphoproliferation in germinal centres. Recombinant viruses were engineered by mutagenesis of the viral genome cloned as a BAC and tested on their capacity to establish and expand a latent load in the spleen and their ability to maintain a long-term persistence. Both recombinant viruses displayed a major deficit in splenic latency, incapable of establishing and maintaining a latent infection. The introduced delection in mLANA did not affected its nuclear localization as well its expression as it was assessed by immunofluoresce assay and immunoblotting, respectively. These results suggested that the mutations in mLANA somehow rendered recombinant viruses inaptitude to attach to host chromosomes and thus maintain a latent infection. The overall results showed that vD2 and vD2L92A are not useful to study the molecular pathways critical for virus-induced lymphoproliferation. New strategies must be developed in order to potentiate tumorigenesis.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15752
Designação: Biologia (Microbiologia Aplicada)
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