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Título: Enzimas microbianas com centros diférricos na resposta ao stresse oxidativo
Autor: Carrilho, Joana Lúcia Pereira, 1990-
Orientador: Teixeira, Miguel Nuno Sepúlveda de Gouveia
Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-
Palavras-chave: Stress oxidativo
Escherichia coli
Enzimas
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Este trabalho pretende estabelecer o papel de rubreritrinas na resposta microbiana ao stresse oxidativo, nomeadamente na redução do peróxido de hidrogénio. Selecionou-se um patogéneo gastrointestinal, contendo a rubreritrina e os parceiros fisiológicos, cujos genes foram selecionados para posterior clonagem em E.coli. As rubreritrinas são uma vasta família de enzimas, presentes em procariotas aeróbios e anaeróbios (Bactéria e Archaea), bem como em protozoários anaeróbicos. Em conjunto com as redutases do superóxido, constituem uma família de enzimas que destoxificam espécies reativas de oxigénio através da sua redução, acoplada à oxidação de equivalentes redutores do NAD(P)H. Este tipo de reatividade contrasta com as enzimas clássicas, que realizam a destoxificação através da dismutação do ião superóxido ou do peróxido de hidrogénio Para tal efetuou-se a purificação e caraterização bioquímica e funcional da rubreritrina e rubredoxina. Para a reconstituição da cadeia enzimática, utilizou-se uma NADH:rubredoxina oxidoredutase de E.coli. Dos estudos efetuados, observou-se que a rubreritrina tem uma massa molecular de 20,4 kDa e uma cor rosa caraterística. O espectro de Ultra-violeta/visível apresenta picos caraterísticos a 373 nm, 493 nm e 560 nm. Isto sugere a presença dos dois átomos de ferro no centro inserido no domínio de quatro hélices, e do ferro no centro rubredoxina. A proteína é reduzida pelo ditionito de sódio; e após exposição ao ar, reoxida. Demonstrou-se a capacidade desta proteína reduzir o peróxido de hidrogénio, dependente da oxidação do NADH. Determinou-se uma atividade de 34,6 μmol H2O2 min-1 mg-1, bastante superior ao proposto para outras rubreritrinas o que pode ser explicado pela ausência de outros sistemas de destoxificação de H2O2 no patogéneo em estudo.
This study aims to determine the role of microbial rubrerythrins in response to oxidative stress, including the reduction of hydrogen peroxide. It was selected a gastrointestinal pathogen, containing rubrerythrin and its physiological partners, whose genes were used for further cloning in E.coli. Rubrerythrins are a large enzyme family present in aerobic and anaerobic prokaryotes (Bacteria and Archaea), as well as in anaerobic protozoa. Together with superoxide reductases, constitute an enzyme family that detoxify reactive oxygen species by its reduction, coupled to oxidation of reducing equivalents in the form of NAD(P)H. This type of reactivity contrast with the classic enzymes that perform detoxification by dismutation of the superoxide ion and hydrogen peroxide. For this we performed the purification and biochemical and functional characterization of rubrerythrin and rubredoxin. For reconstitution of the enzymatic chain, we had to use a NADH:rubredoxin oxidoreductase from E.coli. From the perfomed studies, it was observed that the rubrerythrin has a molecular mass of 20.4 kDa and a characteristic pink color. The visible spectrum shows characteristic bands at 373 nm, 493 nm and 560 nm. This suggests the presence of two iron atoms in the center of the four-helix bundle domain and iron the rubredoxin center. The protein is reduced by sodium dithionite; and reoxidies after exposure to air. It was demonstrated the ability of this protein to reduce the hydrogen peroxide, linked to NADH oxidation. It was determined by an activity of 34.6 μmol of H2O2 min-1 mg-1, much high er than that proposed for other rubrerythrins which can be explained by the absence of other detoxification H2O2 systems in the pathogen under study.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15755
Designação: Mestrado em Biologia (Microbiologia Aplicada)
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