Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15760
Título: Evolution of Escherichia coli in the mouse gut
Autor: Lourenço, Marta Mansos, 1991-
Orientador: Sousa, Ana Margarida
Dionísio, Francisco, 1971-
Palavras-chave: Escherichia coli
Intestinos
Expressão génica
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: The role of bacterial diversity is not completely understood. Several factors can shape this diversity, either within a host or in an external environment. It is important to understand this process and its driving forces both in ecological and evolutionary terms. In this thesis, we study bacterial adaptation to the mammalian gut, which is one of the most complex bacterial environments. The mammalian gut is also thought to be variable over time. To thrive in an environment such as this, the accumulation of adaptive mutations is essential. In populations where several beneficial mutations segregate simultaneously, many small effect mutations are lost due to competition with the ones of larger effect, a process known as clonal interference (CI). As an adaptive walk is expected to involve more than one adaptive step, we have studied the adaptive mutation corresponding to the first and second steps of adaptation of Escherichia coli to the mouse gut. We observed an intense process of clonal interference occurring during the first colonization that seems to decrease in the second colonization. This analysis showed that the rate of adaptation of E.coli to the mouse gut seems to be declining as the population adapts. Despite the smaller effect of interference in the second colonization, the comparison of the genetic basis of adaptation from both colonizations revealed a remarkable parallelism (mainly IS driven) in the adaptation of E.coli to the mouse gut which continues to adapt in a second colonization to the gut. We further tested the effect of these mutations in the expression of their respective genes and in the mutant’s fitness when exposed to different carbon sources. The results indicate that oxygen level and the metabolic pressures are important stimulus in the adaptation to the studied environment. In sum, though the gut is a highly complex environment, the repeatability of evolution shows that parallel evolution is not restricted to the laboratory environments and may be very common in nature.
Existe ainda algum desconhecimento sobre o papel da diversidade bacteriana. São muitos os factores que a podem modular, quer num hospedeiro quer num ambiente externo. É importante perceber este processo e as suas forças motrizes tanto em termos evolutivos como ecológicos. Nesta tese abordamos o estudo da adaptação bacteriana ao intestino dos mamiferos, um dos ambientes bacterianos mais complexos. Julga-se que o ambiente dentro do intestino seja muito variável devido a vários factores como os niveis de oxigénio (flutuantes), os nutrientes ingeridos pelo hospedeiro, o pH, o uso de antibióticos e o sistema imunitário. Para prosperar em ambientes como este, a acumulação de mutações benéficas é essencial. Em populações em que diversas mutações benéficas surgem em simultâneo, as de menor perder-se-ão devido á competição com as de maior efeito que se irão fixar. Se esta mutações forem de impacto semelhante será dificil a fixação de uma delas devido a intensa competição entre elas. A este processo dá-se o nome de interferência clonal. O organismo modelo que usámos durante este estudo foi a Escherichia coli MG1655. É uma bacteria anaeróbia facultativa, gram-negativa e com crescimento óptimo à temperatura de 37ºC. É um dos organismos modelos mais bem estudados que para além do crescimento rápido em condições laboratoriais, tem uma base genética bem estabelecida e uma sequência genómica determinada. Embora a E.coli represente menos de 1% das bactérias presentes no intestino humano (1), está descrita como sendo uma das primeiras a colonizar recém-nascidos (primeiras 40 horas após o parto) e ainda recentemente foi descrita como sendo a bactéria mais abundante na placenta humana (2)(3). Alem do mais a E.coli sendo uma bacteria comensal tem a capacidade de se tornar patogénica. Assim torna-se a candidata ideal para estudos de transição nas interacções bacteria-hospedeiro podendo variar entre mutualismo, comensalismo ou até patogenese oportunista (4). Nesta tese procedemos à análise da base genética da adaptação da E.coli MG1655 durante duas colonizações consecutivas do intestino do ratinho. Para isso foi introduzida por “gavage” (que consiste na introdução directa de bactérias no estômago do ratinho por via de um tubo) uma co-cultura de duas estirpes geneticamente iguais com a excepção da fluorescência codificada no seu genoma (5). Como ancestral da segunda colonização foi usado um dos clones isolados das populações evoluidas durante a primeira colonização. A base genética dos clones evoluídos nestas duas colonizações foi descrita com base em dados de sequenciação do genoma completo (WGS – whole genome sequencing). A análise genética dos clones mostrou um grande paralelismo entre as mutações adaptativas que surgiram na primeira e segunda colonizações. O primeiro passo adaptativo correspondeu à inactivação do operão gat ( responsável pelo metabolismo do galactitol). O segundo passo caracterizou-se pela a inserção de uma sequência de inserção (IS) nas regiões regulatórias de quatro genes o dcuB, focA, arcA e o yjjP, pela inserção de um IS na região codificante dos genes radA e oppB e ainda por uma mutação pontual (ou pequenas deleções ou inserções) no gene srlR. Sendo alguns destes genes de elevada importância para a bactéria (por exemplo o gene arcA é um dos reguladores mais importantes na passagem de respiração aeróbia para anaeróbia) questionou-se qual seria o papel dos elementos IS na região regulatória destes genes. Estes IS poderiam inactivar o gene, aumentar ou diminuir a sua expressão. Para investigar esta questão medimos o efeito da presença dos elementos IS na expressão dos respectivos genes. Algumas demonstraram possuir um efeito significativo na expressão dos genes, sendo este dependente da presença de oxigénio no meio de cultura, apoiando a possibilidade de os niveis de oxigénio serem uma das pressões selectivas mais importantes dentro do intestino. O efeito destas mutações revelou ainda que os elementos IS têm um papel fundamental neste processo adaptativo a que a E.coli está a ser sujeita. Para além dos genes alvo de inserções medimos ainda a expressão do gene srlA, uma vez que este gene faz parte do operão responsável pelo metabolismo do sorbitol estando sob controlo directo do repressor srlR (um dos genes mais atingido durante as duas colonizações). Verificámos que o gene srlA teve um aumento de expressão tanto em aerobiose como em anaerobiose demostrando assim que o sorbitol é provavelmente uma fonte de carbono importante para a E.coli no intestino. Para melhor perceber as dinâmicas desta adaptação da E.coli ao intestino do ratinho determinámos ainda a diversidade de haplótipos ao longo do período adaptativo de algumas das populações das duas colonizações. A análise desta diversidade revelou um regime de interferência clonal em ambas as colonizações (mostrando um dinâmica de “soft sweeps” que consiste no aparecimento de várias mutações ao mesmo tempo competindo entre elas mas nunca conseguindo a fixação na população). Esta interferência aparenta ser inferior na segunda colonização pois o número de haplótipos com mais de uma mutação a surgirem durante a primeira colonização é muito superior aos número dos da segunda colonização. Este estudo revelou ainda a presença de uma população com uma dinâmica adaptativa diferente em que uma das mutações do segundo passo de adaptação se fixou (evidenciando uma dinâmica de “hard sweep” que consiste no aparecimento de uma mutação benéfica que se fixa na população). Estas observações levam à conclusão de que a adaptação parece estar a diminuir apresentando ainda dinâmicas de adaptação diferentes das representadas na primeira colonização. Para além disso estudámos ainda as potenciais pressões metabólicas presenciadas pela E.coli no interior do intestino. Para isso realizámos competições in vitro na presença de um conjunto de diferentes fontes de carbono a baixas e altas concentrações no meio de cultura. As fontes de carbono usadas foram o gluconato, o glucuronato, a manose e a ribose descritos como importantes para a E.coli quando dentro do intestino. O sorbitol foi tambem utilizado pois o seu metabolismo é um dos alvos de mutação. Os resultados destes ensaios suportam a hipótese da E.coli no intestino do ratinho estar a evoluir para o consumo de várias fontes de carbono em simultâneo e em baixas concentrações, por outras palavras estes clones estão a evoluir para serem generalistas num ambiente pobre em nutrientes. Os resultados aqui apresentados demonstram um grande paralelismo na adaptação da E.coli ao intestino do ratinho. A reprodutibilidade da evolução da E.coli no ambiente complexo do intestino mostra que a evolução paralela não está restrita aos ambientes de laboratório mas também pode ser comum em ambientes naturais.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15760
Designação: Mestrado em Biologia (Microbiologia Aplicada)
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