Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15781
Título: Analysis of molecular diversity and cis-regulatory elements in the promoters of lignin genes in Eucalyptus species
Autor: Pereira, Priscila Miriam Santos, 1990-
Orientador: Fevereiro, Pedro, 1959-
Paiva, Jorge Almiro B. C. Pinto
Palavras-chave: Eucalipto
Lenhina
Transcrição genética
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: O género Eucalyptus tem grande importância comercial e ecológica. Os eucaliptos são as principais espécies produtoras de madeira usadas na indústria da celulose e pasta de papel. A quantidade e a composição em lenhina na madeira é uma das maiores barreiras para a qualidade da polpa. Vários estudos têm surgido para a identificação dos mecanismos de transcrição e pós-tradução envolvidos no controlo da lenhificação. Apesar disso, são muitas as lacunas na compreensão desses mecanismos, nomeadamente no género Eucalyptus. A regulação da transcrição é determinante na regulação da expressão génica. A região promotora contém elementos cis-regulatórios que se ligam a fatores de transcrição específicos, dirigindo a expressão espacial e temporal da transcrição. O conhecimento da composição dos promotores em elementos cis-regulatórios é essencial para a compreensão dos mecanismos inerentes à regulação da transcrição. Nos últimos anos têm surgido várias ferramentas bioinformáticas para a predição destes elementos nos promotores. Este tipo de metodologia é desenvolvido, maioritariamente, por comparação de regiões reguladoras ortólogas, de um mesmo gene em várias espécies com diferentes graus de divergência e polimorfismo. Desta forma tem sido possível, ao perceber quais os motivos com maior probabilidade de possuírem função biológica, economizar tempo e recursos no decorrer do projeto experimental. Os fatores de transcrição (FT) da família MYB ligam-se a elementos cis-regulatórios específicos nos promotores de vários genes que codificam para enzimas envolvidas nas vias biossintéticas dos fenilpropanóides e lenhina. A existência comum destes elementos nos promotores de vários genes da via da lenhina tem suportado a hipótese de que estes são regulados de forma coordenada a nível transcricional. Existem outros FT, que em cooperação com os FT da família MYB, são responsáveis pela regulação coordenada dos genes da via biossintética da lenhina. A melhor compreensão desta via passa pela descoberta de novos elementos cis-regulatórios, tendo em conta a evolução e função de famílias de genes da biossíntese de lignina em todo o género Eucalyptus. Nesta dissertação é descrita a análise da região promotora de quatro genes envolvidos na via biossintética da lenhina, PAL9, F5H2, CSE e CAD3, isolados a partir de nove espécies do género Eucalyptus. A análise foi realizada em termos de diversidade nucleotídica, composição e conservação em elementos cis-regulatórios. Dos 30 pares de primers desenhados para amplificação por PCR da região promotora de cada gene pertencente à via biossintética da lenhina em eucalipto, foram escolhidos 11 para amplificação da região promotora de 62 espécies do género Eucalyptus e quatro do género Corymbia. Dez dos 11 pares de primers amplificaram com sucesso em mais de metade das espécies analisadas, sendo que o sucesso total na amplificação foi de 73%. Estes resultados confirmaram a existência de um grau de conservação considerável entre os promotores ortólogos. As espécies com menor sucesso na amplificação foram as espécies pertencentes ao género Corymbia e aquelas pertencentes ao subgénero Eucalyptus (género Eucalyptus). Estes resultados eram espectáveis uma vez que estas espécies são as mais afastadas filogeneticamente da espécie E. grandis, para o qual os primers foram desenhados. Com base na hipótese de que os promotores contêm regiões específicas mais conservadas, garantindo a manutenção e funcionalidade de elementos cis-regulatórios, foi realizada uma abordagem genómica comparativa ao nível da espécie. Para isso, as regiões promotoras dos genes PAL9, F5H2, CSE e CAD3 foram amplificadas por PCR para um indivíduo de cada uma de 9 espécies do género Eucalyptus, 7 delas pertencentes ao subgénero Symphyomyrtus. Posteriormente, estas regiões promotoras foram diretamente sequenciadas, e em alguns casos primeiramente clonadas e só depois sequenciadas. Foram seguidamente alinhadas para uma análise mais detalhada em termos de diversidade nucleotídica (π) e para identificação e mapeamento de elementos cis-regulatórios. De uma forma geral a diversidade nucleotídica foi elevada. Os valores de π variaram de 0.026, para as regiões promotoras PAL9 a 0.078 para as regiões promotoras CAD3. O facto da enzima fenilalanina amónia-liase (PAL) ser essencial para a síntese de todos os fenilpropanóides, catalisando o primeiro passo dessa via biossintética, pode ser a razão da manutenção deste promotor ao longo do processo de divergência e especiação. Apesar dos elevados valores de π, foram identificadas regiões específicas, em todos os grupos de promotores, com valores de diversidade nucleotídica espectáveis para regiões codificantes conservadas (π inferior a 0.02), podendo significar a existência de restrições funcionais para essas regiões. O conjunto de elementos cis-regulatórios putativos mapeados ao longo das regiões promotoras analisadas foi obtido por uma seleção prévia através de duas estratégias. A primeira foi a identificação de elementos cis-regulatórios por homologia com elementos cis-regulatórios descritos na base de dados PLACE. Essa identificação foi realizada nas regiões promotoras (1000pb anteriores ao ATG) de todos os genes pertencentes à via biossintética da lenhina em eucalipto e dos respetivos ortólogos nas espécies A. thaliana, P. trichocarpa and V. vinífera, consistindo num total de 75 sequências. De um total de 219 elementos identificados, foram selecionados 32 elementos representativos do conjunto de dados, sendo mais provavelmente envolvidos na regulação génica da lenhina. A segunda estratégia utilizada consistiu na identificação in silico de motivos sobrerepresentados no conjunto das mesmas 75 sequências, utilizando para essa deteção três programas, MEME, MotifSampler e oligo-analysis (RSAT). A ferramenta STAMP foi utilizada para agrupar os 77 motivos, identificados pelo conjunto dos três programas, por similaridade e redundância. Isto permitiu obter um conjunto de cinco novos elementos-cis putativos que não seriam normalmente identificados por pesquisas em bases de dados. Três deles foram identificados por mais do que um programa, aumentando a confiabilidade e precisão da predição. O mapeamento do conjunto de elementos cis-regulatórios previamente selecionados, nos quatro grupos de promotores, permitiu verificar a existência de um padrão de conservação nas espécies de eucalipto. Ao analisar o efeito potencial da evolução das sequências de DNA nas ocorrências de elementos cis-regulatórios identificados em regiões de baixa diversidade nucleotídica, nos quatro grupos de promotores, verificou-se que mais de metade dessas ocorrências de elementos-cis (52%) eram conservadas nas sequências promotoras das nove espécies em análise. Ainda assim, foram identificados alguns casos, a maioria em E. tereticornis (56%), onde alterações nucleotídicas causaram a perda de determinado elemento-cis putativo, nas espécies onde essas alterações ocorreram. As diferenças encontradas na região promotora de mais do que um gene, na espécie E. tereticornis, poderão ter implicações na regulação transcricional dos genes da lenhina nesta espécie. Os elementos CRPE31, GT1CONSENSUS, SEF4MOTIFGM7S, PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A e o motivo sobrerepresentado LRPE2, identificado de novo neste estudo, foram identificados com múltiplas ocorrências em todos os grupos de promotores ortólogos. Indicando a sua eventual importância na regulação de genes com expressão sincronizada ou no controlo dos níveis de mRNA. Para além disso, todos estes elementos foram identificados, nas regiões promotoras de um ou mais genes, em regiões com valores de π inferiores a 0.02 podendo ter potencialmente maiores restrições funcionais. Adicionalmente, todos estes elementos, exceto o PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A, parecem estar posicionalmente conservados nas regiões promotoras de genes diferentes. Esta informação pode ser relevante pois a posição relativa dos elementos tem influência nos perfis de transcrição dos genes. Todos os elementos-cis necessitam de validação experimental. Ainda assim, todas estas evidências em consonância com as funções biológicas dos vários elementos descritas em literatura permitiram perceber de forma mais concreta quais as funções putativas destes elementos nos promotores dos genes da lenhina em Eucalyptus. Em conclusão, este trabalho permitiu compreender novos aspetos da diversidade e evolução dos promotores de genes da lenhina em Eucalyptus. Além disso, foram revelados elementos cis-regulatórios que podem ser responsáveis por aumentar a atividade dos promotores ou pelo controlo temporal e/ou espacial da expressão de vários genes no decorrer da biossíntese da lenhina em Eucalyptus. Esta informação será capaz de acelerar a caracterização funcional de novos elementos cis-regulatórios e dos respetivos FT, sendo um passo fundamental na compreensão da regulação transcricional da via biossintética da lenhina e da sua heterogeneidade no género Eucalyptus.
The genus Eucalyptus has great commercial and ecological importance, being the principal hardwood species used for pulp and paper manufacturing. The fact that the quantity and composition of lignin in wood has implications in pulping quality and bioethanol production has made lignin biosynthesis an extensively studied pathway. However, more information regarding diversity and transcriptional regulation of the genes involved in the lignin regulation biopolymer is needed. In this work a comparative analysis of orthologous phenylpropanoid-lignin genes promoters from four angiosperm genera Eucalyptus, Arabidopsis, Populus and Vitis, was performed to identify overrepresented conserved and novel motifs being putative cis-regulatory sequences (CREs). Comparative analysis identified 33 conserved sequence motifs, consisting of known and novel CREs, significantly overrepresented in those promoter sequences. Subsequently, were analyzed patterns of species-level nucleotide diversity and the distribution and composition in putative cis-regulatory elements in the promoters of four phenylpropanoid-lignin genes from different Eucalyptus tree species using in silico tools. Species-level nucleotide diversity (π) varied from 0.026 to 0.078, and the different lignin promoters studied showed different patterns of sequence conservation. All the promoters of the studied Eucalyptus lignin genes contained highly conserved regions at the species level. Some putative CREs were identified in all the promoters with multiple occurrences and positioned in specific regions with low nucleotide diversity. This suggested functional restrictions on such regions and biological function for those specific motifs. These findings provide new information capable to accelerate the functional characterization of CREs and their interacting TFs responsible for driving high or specific activity of corresponding promoters in lignin biosynthesis in Eucalyptus. Thus, this work contributes to a step forward in the understanding of the mechanisms underlying the regulation of lignin heterogeneity in Eucalyptus. This knowledge, in turn, will benefit Eucalyptus breeding programs or enable the alteration of lignin composition, increasing its degradability in industrial processes.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15781
Designação: Mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética)
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