Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15782
Título: Screening for new Ffz fructose transporters and possible correlation with fructophily in yeasts
Autor: Cabral, Sara Catarina Barroso, 1990-
Orientador: Leandro, Maria José
Duarte, Júlio António Bargão, 1957-
Palavras-chave: Zygosaccharomyces
Frutose
Leveduras
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Várias leveduras pertencentes ao género Zygosaccharomyces, como Z. rouxii e Z. bailii, são responsáveis pela deterioração de alimentos e bebidas como vinho, refrigerantes, sumos de frutas, mel, molhos para saladas e outros produtos de reconhecida importância económica, devido à sua capacidade de se multiplicarem em condições inóspitas (que restringem o crescimento da maioria dos microrganismos), como baixa atividade da água (aW), baixos valores de pH e presença de ácidos fracos. Não obstante, estas leveduras são usadas na produção industrial de certos alimentos e bebidas, nomeadamente Z. rouxii, que é utilizada na produção de vinagre balsâmico e durante a fermentação alcoólica da pasta de miso e molho de soja. Z. bailii também se apresenta como bom candidato para alguns processos biotecnológicos sob condições restritivas, como produção de lactato, ácido L-ascórbico e vitamina B12, devido à sua elevada resiliência, taxa especifica de crescimento e produção de biomassa. Outra peculiaridade destas leveduras é que, contrariamente à maioria das leveduras, e em particular S. cerevisiae, consomem preferencialmente frutose em relação à glucose, tendo assim a designação de leveduras frutofílicas. Inicialmente foi descrito que o transporte de frutose em Z. bailii e Z. rouxii é mediado por um sistema de transporte específico para frutose de elevada capacidade e baixa afinidade e por um sistema de transporte de baixa capacidade e elevada afinidade, que também transporta glucose. Nestas leveduras a frutose compete com a glucose para os transportadores de hexoses e promove a inativação dos transportadores de glucose, reduzindo a utilização deste açúcar enquanto houver frutose disponível (sendo essa inativação mais rápida a concentrações mais elevadas de frutose). Em Z. bailii e Z. rouxii encontra-se caracterizado um tipo peculiar de transportadores de açúcares por difusão facilitada de elevada capacidade e baixa afinidade, as proteínas Ffz. Em ambas as leveduras foram caracterizados transportadores do tipo Ffz1 (Fructose facilitator Zygosaccharomyces) específicos para frutose (ZbFfz1 e ZrFfz1); e em Z. rouxii um outro transportador que transporta glucose e frutose com semelhante capacidade e afinidade (ZrFfz2). Estes três transportadores pertencem a uma nova família, filogeneticamente distinta da família a que pertencem os demais transportadores de hexoses caracterizados até à data (Sugar Porter Family, SP), sendo mais semelhantes do ponto de vista filogenético aos transportadores de drogas da família DHA1 (Drug/H+ Antiporter 1 family). Recentemente foi também caracterizado em Z. rouxii um transportador específico para frutose, por um mecanismo de simporte com protões, de baixa capacidade e alta afinidade (ZrFsy1 – Fructose symporter). Contrariamente às proteínas do tipo Ffz, este transportador pertence á família SP e só é expresso em concentrações muito baixas de frutose (<0,2% (p/v)) ou em fontes de carbono não fermentescíveis, como manitol e xilitol. Além do FFZ1 de Z. bailii já caracterizado, três outros genes do tipo FFZ foram identificados no genoma recentemente sequenciado de Z. bailii ISA 1307. No genoma da estirpe tipo Z. bailii CLIB 213T (CBS 680) que também já se encontra disponível, parecem estar presentes dois genes do tipo FFZ. Na levedura frutofílica Candida magnoliae, foi também referida a presença de uma proteína do tipo Ffz, cujos parâmetros cinéticos revelaram ser um transportador específico para frutose de elevada capacidade e baixa afinidade, CmFfz1. Recentemente, Leandro et al., descreveu o papel essencial do transportador Ffz1 de Z. rouxii CBS 732T no caráter frutofílico desta estirpe, uma vez que, após a deleção do gene FFZ1 esta levedura perdeu a sua característica frutofilica, passando a consumir simultaneamente glucose e frutose. Quando este gene foi novamente inserido nesta levedura, o comportamento frutofílico inicial foi recuperado. Por outro lado, quando se efetuou a deleção do gene FFZ2 (que codifica para um transportador de glucose e frutose), não foram observadas alterações no comportamento frutofílico de Z. rouxii CBS 732T. Este estudo mostra que, pelo menos em Z. rouxii CBS 732T, o transportador específico de frutose Ffz1 é essencial ao caráter frutofílico desta levedura. Tendo em conta estas evidências e uma vez que até à data, este novo tipo de transportadores de hexoses (Ffz) foi apenas caracterizado em estirpes de leveduras frutofílicas, surgiu a hipótese de uma possível correlação entre a presença deste tipo de transportadores e o caráter frutofílico das leveduras e que, portanto, outras leveduras frutofílicas poderiam também ter estes transportadores. No sentido de testar essa hipótese, foram desenhados primers degenerados com base em alinhamentos múltiplos de sequências proteicas de transportadores Ffz (ZbFfz1, ZrFfz1 e Zrffz2) e sequências proteicas de possíveis proteínas do tipo Ffz de fungos filamentosos, para um rastreio por PCR em várias leveduras, nomeadamente pertencentes aos géneros Zygosaccharomyces; leveduras que anteriormente pertenceram ao género Zygosaccharomyces (ex: Torulaspora microellipsoides, Zygotorulaspora florentina, Lachancea fermentati); leveduras já descritas como frutofílicas (C. magnoliae); e leveduras filogeneticamente próximas desta última (ex: Starmerella bacillaris). Foram também testadas espécies de leveduras descritas como glucofílicas (ex: S. cerevisiae e Debaryomyces hansenii) como controlos negativos. De forma a poder correlacionar a presença/ausência de genes FFZ com o caráter frutofílico/glucofílico das leveduras em estudo, foram realizados ensaios de crescimento em meio com quantidades equimolares de glucose e frutose, nos quais o consumo destes açúcares foi avaliado por kits enzimáticos ao longo da curva de crescimento. Os resultados confirmam a presença de genes do tipo FFZ em muitas das leveduras testadas, nomeadamente em todas as espécies de Zygosaccharomyces, Starmerella bacillaris (C. zemplinina), St. bombicola (C. bombicola) e nas duas estirpes de C. magnoliae testadas. Utilizando as sequências proteicas de Ffzs correspondentes às obtidas da amplificação com os primers degenerados e recorrendo às sequências de transportadores de hexoses e de drogas das famílias SP e DHA1, respetivamente, foi construída uma árvore filogenética pelo método neighbor-joining na qual é notório o agrupamento dos transportadores do tipo Ffz numa nova família filogeneticamente distinta da família SP, reforçando a existência de uma nova e importante família de transportadores de hexoses. Além disso, pela avaliação da preferência no consumo de glucose e frutose ao longo da curva de crescimento, parece haver uma correlação entre a existência destes transportadores e o caráter frutofílico das leveduras, uma vez que em todas as leveduras nas quais foram detetados genes do tipo FFZ foi observado um comportamento frutofílico. Um Ffz2 de Z. bailii ISA 1307 foi clonado por recombinação homóloga na estirpe de S. cerevisiae hxt-null, para futura caracterização cinética e fenotípica. Resultados preliminares indicam que ZbFfz2 tem um valor de Km para glucose mais elevado que o do seu homólogo em Z. rouxii CBS 732T, ou seja, uma afinidade mais baixa para a glucose, mas semelhante afinidade para a frutose. Uma vez que, em fungos filamentos existem proteínas com uma elevada similaridade (60-67%) com as proteínas Ffz e até à data estes transportadores só foram caracterizados em leveduras, um hipotético transportador o tipo Ffz de Aspergillus niger ATCC 16404 foi clonado por recombinação homóloga na estirpe de S. cerevisiae hxt-null (sem os seus transportadores de hexoses nativos) de forma a poder estudar-se individualmente o transportador em termos de caracterização fenotípica e determinar os respetivos parâmetros cinéticos, Km e Vmáx. Verificou-se que o transportador de A. niger clonado é um transportador do tipo Ffz1, específico para frutose, de elevada capacidade (7,75 ± 1,41 mmol h-1 g-1 peso seco) e baixa afinidade (114,13 ± 37,39 mM), confirmando a existência deste tipo peculiar de transportadores também em fungos filamentosos. Esta evidência sugere que eventos de transferência horizontal de genes possam ter ocorrido entre leveduras e fungos filamentosos e que os transportadores do tipo Ffz confiram vantagem evolutiva aos organismos que os possuam. Além do mais, no sentido de correlacionar a presença de um transportador do tipo Ffz1 em A. niger ATCC 16404 com a preferência no consumo de açúcares (frutose e glucose), irão ser realizados ensaios de crescimento para determinar o caráter glucofílico ou frutofílico desta estirpe. A caracterização de outras hipotéticas proteínas do tipo Ffz de outros fungos filamentosos poderá contribuir para uma melhor compreensão desta nova família de transportadores de hexoses.
Contrary to most yeasts, that usually prefer glucose, Zygosaccharomyces rouxii and Z. bailii, the most important food spoilage yeasts, are fructophilic, i.e., they consume fructose faster than glucose. Another peculiar characteristic of these yeasts is the presence of a different type of hexose transporters, the Ffz proteins, that seem to belong to a new family phylogenetically unrelated to the hexose transporters characterized so far that belong to the Sugar Porter family. In Z. bailii a specific fructose facilitator, ZbFfz1, and in Z. rouxii two similar transporters, ZrFfz1, a fructose-specific facilitator, and ZrFfz2, a fructose/glucose facilitator were characterized. Surprisingly, these Ffz proteins are closer to the Drug/H+ Antiporter 1 family, suggesting the emergence of a new family of sugar transporters, unrelated to the Sugar Porter family. As the fructophilic behavior of Z. bailii and Z. rouxii seems to be related to hexoses transport kinetics, a possible correlation between the presence/absence of Ffz transporters and the fructophilic/glucophilic character of yeasts was hypothesized. To test this hypothesis, degenerate primers were designed based on the FFZ gene sequences (ZbFfz1, ZrFfz1, ZrFfz2) and gene sequences from fungi’s putative Ffz proteins, to screen several yeasts, mainly from genus Zygosaccharomyces, for the presence of this type of transporters. The glucophilic/fructophilic behavior of the strains was also evaluated in order to correlate the presence of the FFZs screened and the sugar preference of the strains. The results confirm the presence of FFZ-like genes in many of the tested species, reinforcing the emergence of a new and important family of sugar transporters and point to a correlation between presence of Ffz proteins and fructophilic behavior. Furthermore, a putative FFZ-like gene from Aspergillus niger ATCC 16404 was cloned in an hxt-null S. cerevisiae strain and its kinetic characterization was performed. This transporter is a fructose-specific low-affinity, high-capacity facilitator, i.e., a Ffz1-like protein.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15782
Designação: Mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética)
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
ulfc107492_tm_sara_cabral.pdf2,12 MBAdobe PDFVer/Abrir    Acesso Restrito. Solicitar cópia ao autor!


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.