Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15815
Título: Role of Wnt pathway on rheumatoid arthritis
Autor: Daniel, Ana Henrique Baptista, 1991-
Orientador: Lopes, Joana Ribeiro Caetano, 1982-
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Palavras-chave: Artrite reumatóide
Estrutura molecular
Ossos
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Artrite Reumatóide (AR) é uma doença crónica, inflamatória autoimune que afeta principalmente as articulações periféricas como as mãos e os pés, cuja causa é ainda ainda desconhecida. Esta doença tem uma incidência de cerca de 1% na população mundial, com maior prevalência no sexo feminino. As principais queixas por parte dos doentes são as articulações inchadas e dolorosas, rigidez matinal e fadiga. Para além destas queixas, esta doença é caracterizada a nível radiológico pela presença de erosões ósseas e destruição articular. Atualmente não existe um cura para esta doença, no entanto existem diversos tratamentos para melhor os sintomas e diminuir a progressão da AR: anti-inflamatórios não esteróides, corticosteróides, imunossupressores e mais recentemente drogas antirreumáticas biológicas, sendo estes últimos o tratamento mais inovador e melhorando significativamente a qualidade de vida destes doentes. Em doentes com artrite reumatóide ocorre infiltração do espaço sinovial entre as articulações por células do sistema autoimune que induzem a proliferação e ativação excessiva dos osteoclastos, que são as células responsáveis pela reabsorção óssea. Embora não sejam totalmente conhecidos os mecanismos que levam a este fenómeno, doentes com AR têm elevada reabsorção óssea que não é compensada pela formação óssea, devido a um comprometimento na proliferação e função dos osteoblastos, células responsáveis pela formação óssea. Ocorre assim um desequilíbrio que leva à perda de mineral óssea, sendo que muitos destes doentes sofrem de osteoporose secundária à inflamação. Ao nível dos osteoblastos, a via de sinalização Wnt controla a proliferação, ativação e funcionalidade destas células. Esta via pode ser inibida por diferentes proteínas, sendo as mais conhecidas DKK1, DKK2, SFRP1, SOST e WIF1. Segundo o que está descrito, a expressão dos inibidores da via de sinalização Wnt é induzida por fatores inflamatórios presentes nas membranas sinoviais de doentes com artrite reumatoide. Assim, a nossa hipótese é que a expressão destes inibidores está aumentada no osso de doentes com AR, o que leva a uma inibição dos osteoblastos. Para isso, doentes com diagnóstico de AR segundo os critérios ACR/EULAR revistos em 2010 submetidos a artroplastia total da anca entre 2007 e 2014 no Serviço de Ortopedia do Hospital de Santa Maria, Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE foram selecionados de uma coorte armazenada no Biobanco-IMM (Centro Académico de Medicina de Lisboa). No Biobanco estavam armazenadas as cabeças femorais de doentes com AR submetidos próteses artroplastia total da anca (n=12) e ainda uma amostra de sangue. Como controlos, doentes com osteoartrose (OA) e osteoporose (OP) foram escolhidos da mesma coorte, com igual distribuição de sexo, idade e índice de massa corporal que os doentes com AR. De cada cabeça femoral foram recolhidos dois cilindros de diferente diâmetro, para testes mecânicos de compressão, colorações estruturais com hematoxilina e eosina, imunohistoquímica e ainda quantificação da expressão génica do osso trabecular. Realizámos ainda quantificação sérica de marcadores de remodelação óssea, P1NP marcador para a formação e CTX-I marcador para a reabsorção óssea. Como modelo animal foram utilizados ratos Wistar com artrite induzida por adjuvante. Os valores do índice inflamatório, o peso e o perímetro do tornozelo foram registados ao longo dos 22 dias pós indução da doença e os animais foram eutanaziados ao vigésimo segundo dia. Após a eutanásia foi recolhida uma amostra de sangue por punção cardíaca e os ossos longos e as vertebras foram também armazenados. Os níveis séricos dos marcadores de remodelação óssea (CTX-I e P1NP) foram quantificados. As vértebras foram recolhidas para histomorfometria, os fémures para testes mecânicos e quantificação do conteúdo mineral (por espectroscopia de energia dispersada por raios-X) e as tíbias para quantificação da expressão génica. Ao comparar os doentes com AR e OA, não encontrámos quaisquer diferenças nos marcadores séricos CTX-I e P1NP, nos testes mecânicos de compressão nem ao nível da expressão génica do osso. Na comparação entre doentes com AR e OP, não encontrámos diferenças nos marcadores séricos de formação e reabsorção óssea, nem nos testes de compressão. No entanto, ao nível da expressão génica, os doentes com AR têm menor expressão de COL1A1 (gene que codifica o colagénio), RANKL (fator de diferenciação dos osteoclastos), WNT10B (proteína sinalizadora da via de sinalização Wnt), DKK1 e SFRP1 (inibidores da via de sinalização Wnt). No modelo animal, Observámos que o marcador de reabsorção óssea (CTX-I) estava diminuídos nos ratos artríticos quando comparados com os saudáveis. Mais ainda, a percentagem de volume ósseo (BV/TV) estava diminuída nos ratos com artrite e a separação média entre as trabéculas (Tb.Sp) era maior nos ratos doentes em comparação com os saudáveis. O conteúdo de cálcio e fósforo estavam também diminuídos nos ratos com artrite o que se traduziu em piores propriedades biomecânicas. No entanto, não encontrámos qualquer diferença na expressão génica. Os resultados obtidos com o estudo em amostras humanas não nos permite comprovar a hipótese postulada. Os resultados obtidos com o modelo animal sugerem que os ratos artríticos sofrem têm maior reabsorção óssea, o que se traduz em menor percentagem de volume ósseo, maior espaçamento médio entre as trabéculas e menor percentagem dos minerais constituintes da hidroxiapatite, cálcio e fósforo. Estas observações refletem-se em piores propriedades mecânicas no osso artrítico, sendo que este atinge o ponto em que perde a elasticidade e sofre a primeira fratura com uma menor força aplicada. Apesar de não conseguirmos confirmar ao nível da expressão génica que os inibidores da via Wnt estavam aumentados ao nível do osso em ratos com artrite, a expressão de genes ligados ao osteoblasto (como o RANKL e o LRP6) estava diminuída nos ratos com artrite. Sendo assim, em amostras com artrite observamos que existe reabsorção óssea aumentada, e que existe um comprometimento nos osteoblastos que não lhes permite formar osso e assim compensar a excessiva atividade dos osteoclastos. Isto leva à perda de massa óssea e à perda de massa óssea o que leva a uma maior suscetibilidade a fraturas de baixa intensidade características de doentes osteoporóticos. Infelizmente não conseguimos comprovar a nossa hipótese de que os doentes com artrite têm um comprometimento nos osteoblastos devido à expressão de inibidores da via Wnt no osso. No futuro, serão necessários mais estudos para tentar compreender que mecanismos levam ao comprometimento dos osteoblastos e a íntima relação entre o sistema imune e o tecido ósseo.
Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic inflammatory autoimmune disease that affects the peripheral joints. It is characterized by infiltration of the synovial membrane by immune cells and by bone erosions. These patients have increased bone resorption with low bone formation, leading to loss of bone mass. The low bone formation rate observed in arthritis is due to impairment of osteoblast activity, most likely to a deregulation of the canonical Wnt pathway. Osteoblast proliferation and activity is regulated by the Wnt signaling pathway which itself is controlled by several inhihbitors like Dickkopf proteins and sclerostin. Wnt inhibitors are highly expressed on the synovial membrane of RA patients. Our hypothesis is that the high expression of Wnt inhibitors at the bone level leads to osteoblast impairment in RA. To test our hypothesis we collected the femoral heads of 12 RA patients as well as serum samples. We used gender and age matched osteoarthritis (OA) and osteoporosis (OP) patients as controls. Quantification of serum bone turnover markers, mechanical compressive tests, and trabecular gene expression was performed. We have also used Wistar rats with adjuvant induced arthritis. Rats were euthanized at 22 days post-disease induction. Blood samples and bones were collected, to measure of bone turnover markers, perform histomorphometry, three-point bending, energy-dispersive X-ray spectroscopy and bone gene expression. No differences were found on the comparison of RA and OA patients. No differences were found between RA and OP patients, except that RA patients have decreased expression lower osteoblast gene expression. Arthritic rats have, higher CTX-I levels, lower BV/TV and Tb.Sp., lower Ca and P percentage, and worst mechanical properties than healthy controls. No differences were found on gene expression. Concluding, arthritis-affected bones have an impairment of osteoblasts and consequently worst bone quality, mechanical properties and less mineral content.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15815
Designação: Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
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