Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15816
Título: Family genetics of Paget’s disease of bone
Autor: Santos, Patrícia Alexandra Silva, 1991-
Orientador: Oliveira, Sofia A.
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Palavras-chave: Ossos
Doença de Paget
Variação genética
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Paget's disease of bone (PDB) is a systemic disease characterized by increased bone resorption and formation, causing gradual destruction of parts of the skeleton and subsequent reconstruction of a more fragile bone. PDB has an overall incidence of 2% in the population over 55 years. PDB is a complex disease with multiple genes implicated in its pathogenesis, but in its monogenic form, only one gene (SQSTM1) has been linked to PDB. To identify novel genes causing familial PDB, we performed whole exome sequencing (WES) in six individuals from a Portuguese multiplex family composed of five PDB cases, two unaffected individuals and one individual with unclear diagnosis. Given the uncertain diagnosis for one family member, we conducted two analyses: model 1, in which this individual is considered affected and model 2 where he is unaffected. DNA was captured using the SureSelect Target Enrichment System kit and sequenced using Hiseq2000 (Illumina’s Solexa). We identified three variants (c.C4786T (KIAA1875), c.C53T (NLRC3) and c.T566C (SRL)) in model 1 and one variant (c.G180A (SERINC2)) in model 2 that were present in all affected and absent from the unaffected in next-generation sequencing (NGS) data. Validation of these mutations by Sanger sequencing in all family members revealed that all model 1 mutations were present in all individuals, while the model 2 mutation was present in all family members except the individual with unclear diagnosis. None of these variants were present in a second Portuguese PDB multiplex family. In conclusion, our findings support the notion that bioinformatics analyses of NGS data is a process requiring optimization. We found four novel variants which may cause PDB in this family with an autosomal dominant pattern of inheritance and incomplete penetrance. Further studies in other PDB families are warranted to determine the pathogenic potential of these genes/variants.
Os ossos são um tecido importante do corpo humano com diversas funções, tais como, a protecção dos órgãos, armazenamento de minerais e reservatório para diversas células. Três células essências contribuem para que o tecido ósseo seja continuamente remodelado, preservando a homeostase mineral. Essas células são os osteoclastos, responsáveis pela reabsorção óssea, os osteoblastos, responsáveis pela formação óssea, e os osteócitos, responsáveis pela manutenção da integridade da matriz óssea. Em condições normais, a interacção entre as três células mantém a remodelação óssea equilibrada. No entanto, quando há um desequilíbrio na remodelação óssea podem-se desenvolver doenças, tais como a doença óssea de Paget (DOP). A DOP é uma doença sistémica em que a taxa de reabsorção e formação óssea estão aumentadas, causando uma destruição gradual de partes do osso, e uma consequente reconstrução de um osso mais frágil e desorganizado. A DOP é uma doença complexa com uma incidência de aproximadamente 2% na população com mais de 55 anos. 85% dos indivíduos afectados não manifesta qualquer sintoma, recebendo o diagnóstico para a DOP quando faz exames médicos de rotina. A percentagem de pacientes com sintomas manifesta dores, osteoartrite, fracturas, surdez, entre outros. Estudos sugerem que a doença surgiu no Reino Unido tendo-se depois dispersado para outras partes do mundo, provavelmente devido a fenómenos migratórios. A DOP é assim mais comum no Reino Unido, Austrália, Nova Zelândia, África do Sul, Ásia e em Portugal onde se verifica um foco de indivíduos afectados no Alentejo, mas não se conhece ainda uma causa para esse facto. A etiologia da DOP para a maioria dos casos é desconhecida. Pensa-se que a combinação de variantes comuns e/ou raras em conjunto com factores ambientais que despoletam a manifestação da doença. Dos factores ambientais estudados, o mais defendido como desencadeador da DOP é a infecção pelo paramamyxovirus, tendo-se observado no núcleo e citosol dos osteoclastos partículas parecidas com nucleocapsídeos de paramyxovirus. Os osteoclastos de doentes com DOP manifestam um fenótipo diferentes dos indivíduos não afectados, tendo mais núcleos por célula, resistência à apoptose e reabsorção óssea aumentada. No entanto, os factores ambientais requerem a co-expressão de factores genéticos para o desenvolvimento da doença. Até ao momento, o SQSTM1 é o único gene identificado responsável pelo desenvolvimento da DOP familiar. No entanto, estudos de linkage e associação apontam para um risco aumentado para o desenvolvimento de DOP idiopática em indivíduos com polimorfismos nos genes CSF1, OPTN, TNFRSF11A, TM7SF4, NUP205, RIN3, PML e GOLGA6A. Contudo, são necessários mais estudos para identificar outras variantes causais que explicam a restante variabilidade genética. O nosso objectivo é identificar o(s) gene(s) que causa a DOP numa família Portuguesa com vários indivíduos afectados com DOP oriunda do Alentejo. Para tal, foi solicitado à Beijing Genomics Institute (BGI) Hong Kong que fizesse a sequenciação do exoma (whole-exome sequencing [WES]) dos seis familiares usando next-generation sequencing (NGS). NGS é uma técnica de sequenciação que produz dezenas de fragmentos de DNA (entre 100 a 500 pares de base) num curto período de tempo, que tem vindo a ser aplicada no estudo de diversas doenças monogénicas e complexas. WES é um método robusto para a identificação de variantes raras associadas a doenças complexas visto que o exoma (1-2% do genoma que codifica proteínas) representa uma grande parte do genoma onde é possível identificar variantes que produzem efeitos funcionais. O DNA foi capturado usando o kit SureSelect Target Enrichment System e sequenciado usando a plataforma Hiseq2000 (Illumina’s Solexa). Após verificarmos que a análise bioinformática da BGI continha diversos erros realiza-mos uma nova análise seguindo a pipeline do Broad Institute (Genome Analysis Toolkit (GATK) Best Practices workflow) optimizada para DNA humano, utilizando algumas ferramentas complementares. A pipeline encontra-se dividida em três fases, o processamento dos dados (alinhamento dos fragmentos de DNA com a sequência referência e remoção dos duplicados), a detecção das variantes, e por último a anotação e análise das funções das variantes usando ferramentas in silico (SIFT e PolyPhen-2). Por fim, os dados foram divididos em polimorfismos nucleótidicos simples (SNPs) e inserção e delecção de nucleótidos (InDels), contendo as variantes encontradas para cada indivíduo na região codificante. Para a análise dos SNPs, dividiram-se as variantes em não-sinónimas, sinónimas, ganho de um codão stop (stop-gain) e perda de um codão stop (stop-loss). Para a análise dos InDels dividiram-se as variantes em frameshift insertion/deletion, non-frameshift insertion/deletion, frameshift/non-frameshift block substitution, ganho de um codão stop (stop-gain) e perda de um codão stop (stop-loss). Analisámos ainda as variantes presentes nas regiões regulatórias mas não as validámos. Assumindo que a mutação que causa a DOP nesta família é privada e nova excluímos todas as variantes presentes em bases de dados públicas (dbSNP e 1000 Genomes Project). Como não foi possível obter até à conclusão desta tese o diagnóstico final de um dos familiares, criámos dois modelos de análise distintos, em que para o modelo 1 o indivíduo é considerado afectado e no modelo 2 é considerado não afectado. Pretendemos assim identificar as variantes na região codificante que estão presentes nos indivíduos afectados e ausentes no(s) indivíduo(s) não afectado(s). Validar as variantes identificadas por sequenciação de Sanger não só nos indivíduos sequenciados por WES, mas também nos restantes membros da família e numa nova família oriunda do Alentejo e ver a sua segregação. Estamos interessados em analisar variantes novas (ou seja, que não estão descritas em nenhuma base de dados) visto já existerem diversos estudos em variantes comuns que apenas explicam uma parte da variabilidade genética para a doença. Três novas variantes (c.C4786T (KIAA1875), c.C53T in (NLRC3) e c.T566C (SRL)) foram identificadas utilizando o modelo 1. No modelo 2 identificámos duas novas variantes, c.G180A (SERINC2) e uma delecção no PLEKHG5 (c.2163_2168del). As funções destes genes parecem estar associadas com o metabolismo ósseo, no entanto são necessários mais estudos para confirmar esta associação. A validação destas variantes por sequenciação de Sanger revelou que as três variantes identificadas para o modelo 1 (c.C4786T, c.C53T, and c.T566C) estavam presentes em todos os indivíduos afectados da família 1. No entanto, estas variantes também estavam presentes nos dois indivíduos controlo. Para o modelo 2, verificou-se que a variante c.2163_2168del insere-se numa posição diferente do genoma quando comparado com os resultados de WES, estando já reportada em bases de dados (estando presente em todos os indivíduos afectados e nos dois controlos da família 1, de acordo com a sequenciação de Sanger). Para o modelo 2, a variante c.G180A está presente em todos os indivíduos afectados e nos dois controlos, no entanto está ausente do individuo controlo adicional (incluído apenas no modelo 2). Numa segunda família multiplex Portuguesa com DOP nenhuma destas mutações foi detectada em nenhum membro da família. Podemos concluir que nenhuma destas variantes tem uma segregação perfeita do tipo autossómico dominante com penetrância completa, o que está de acordo com o descrito na literatura. O potencial patogénico destas mutações não pode ser excluído se tivermos em conta que alguns indivíduos da família podem não ter sido ainda diagnosticados clinicamente por não apresentarem sintomas ou por ainda não terem idade para manifestar a DOP. Estudos adicionais devem incluir variantes com uma frequência do alelo menor inferior a 5% e descritas no dbSNP ou 1000 GP. Há várias variantes localizadas em zonas regulatórias que apontam para uma possível associação com a PDB, sendo necessário mais estudos que incluam variantes que se encontram nestas regiões. O número de indivíduos e famílias no estudo devería de ser maior, de modo a melhorar a identificação das variantes causais, e os indivíduos controlo a estudar deveriam de ter uma idade superior à de risco (acima dos 50 anos). A identificação de novas variantes genéticas associadas à DOP pode ajudar a compreender melhor as vias celulares envolvidas na sua patogénese. Deste modo poderão, eventualmente, advir novas terapias mais eficazes e porventura preventivas.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15816
Designação: Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
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