Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15916
Título: Mycobacteriophage Ms6 : exploring the involvement of Gp1 on LysA export
Autor: Martins, Francisco André de Lemos
Orientador: Pimentel, Madalena
Palavras-chave: Mycobacteriophage Ms6
Mycobacteria
Lysis
Ms6 Gp1
Secreted endolysins
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Mycobacteriophage Ms6 is a temperate double-stranded DNA (dsDNA) phage that infects the non-pathogenic Mycobacterium smegmatis. Similarly to what happens with all other dsDNA phages studied so far, Ms6 must compromise host cell integrity in order to release its progeny at the end of the lytic cycle. Ms6 lytic operon is organized into five genes. In addition to the endolysin (lysA) and holin-like genes (gp4 and gp5), two accessory lysis genes are found, gp1 and gp3 (lysB), which reflects a novel mechanism of phage-mediated lysis. lysB encodes an enzyme with lipolytic activity whereas gp1 encodes a chaperone-like protein. Gp1 interacts with the N-terminal region of LysA and enables its access to the peptidoglycan layer in a holin-independent manner. However, some aspects concerning Gp1 role in the lytic process are not completely clear. In this work we present data obtained using a recombinant Ms6 carrying gp1 and lysA fused to tag sequences. Subcellular fractionation of M. smegmatis infected cells revealed that Gp1 is present on the cell wall and cell membrane fractions, while LysA seems to be restricted to the cell wall. Despite the association of Gp1 with the cell envelope, translational fusions with the E. coli alkaline phosphatase gene have shown that Gp1 is not endowed with a signal sequence. These results together with the observation that Gp1 is not able to promote the export of the first 60 amino acids of LysA fused to PhoA’ suggest that Gp1 and LysA are exported as a complex. The association between the two proteins may be important to keep LysA inactive until the proper time of lysis. The study of bacteriophages opens new perspectives regarding the treatment of bacterial infections and, in this case, it may also contribute to a better understanding of the diverse mechanisms employed by bacteriophages to lyse their hosts.
Os bacteriófagos, ou fagos, são os vírus que infectam bactérias. Estima-se que os fagos constituem a entidade biológica mais abundante do planeta Terra, desempenhando um papel importante na ecologia e evolução microbianas. Os fagos podem apresentar uma grande variedade de morfologias, no entanto, até à data, a maioria dos fagos descritos apresenta cauda e um genoma de DNA em dupla cadeia (dsDNA). Tal como todos os vírus, os bacteriófagos requerem células hospedeiras para se poderem multiplicar de forma a gerar descendência. De acordo com o seu ciclo de infecção, os bacteriófagos de dsDNA podem ser divididos em virulentos, se realizarem um ciclo lítico, ou temperados, se concretizarem um ciclo lítico ou lisogénico. Durante o ciclo lítico o fago infecta células hospedeiras e multiplica-se, produzindo novas partículas virais no seu interior que vão poder infectar outras células. Para iniciar a infecção o fago deve adsorver à superfície da célula bacteriana através do reconhecimento de receptores específicos presentes no envelope celular e posteriormente injectar o seu genoma na célula hospedeira. Depois da injecção do genoma fágico, este utiliza a maquinaria do hospedeiro de forma a gerar novas partículas virais, que são libertadas durante a lise celular induzida pelo fago. Durante o ciclo lisogénico, o DNA fágico, depois de ser injectado para o interior da célula tal como acontece com os fagos virulentos, é geralmente integrado no genoma do seu hospedeiro, sendo transmitido as células-filhas aquando da divisão celular. Sob determinadas condições o ciclo lítico pode ser induzido e nesse caso o metabolismo do hospedeiro é redireccionado para produzir novas partículas virais. O fim do ciclo lítico culmina com a lise da célula hospedeira para que os viriões recém-sintetizados possam infectar novas células e assim gerar nova descendência fágica. Para que isto aconteça os fagos devem comprometer as estruturas responsáveis pela integridade da célula hospedeira, nomeadamente a parede celular. Os bacteriófagos de dsDNA, como o fago λ, induzem a lise através da síntese de 2 proteínas essenciais: uma endolisina e uma holina. As endolisinas são enzimas com capacidade de hidrolisar o peptidoglicano, enquanto que as holinas são proteínas membranares de pequenas dimensões que conduzem a uma alteração do potencial de membrana e à formação de lesões na membrana citoplasmática, permitindo o acesso da endolisina ao substrato ou a sua activação. As holinas estão descritas como sendo essenciais para determinar o tempo óptimo da lise, de modo a que a libertação de fagos seja produtiva para a sobrevivência do fago. O modelo de lise, holina-dependente, usado pelo fago λ foi por muito tempo considerado universal, no entanto estudos mais recentes realizados com outros fagos têm revelado que o transporte das endolisinas pode ser feito de forma independente das holinas, nomeadamente através dos sistemas de secreção bacterianos. As endolisinas cujo transporte para o meio extracitoplasmático é independente da holina geralmente apresentam uma sequência sinal que permite a translocação da proteína, através da membrana citoplasmática, utilizando o sistema Sec do hospedeiro. A primeira descrição de uma endolisina contendo uma sequência sinal teve origem em estudos com o fago fOg44 de Oenococcus oeni. Neste caso a endolisina (Lys44) é sintetizada com um péptido sinal que é clivado durante o processo de secreção. Mais recentemente têm sido descritas outras endolisinas, nomeadamente de fagos que infectam bactérias Gram-negativas, que apresentam na sua extremidade N-terminal uma região de carácter hidrofóbico, designada por Signal-Arrest-Release (SAR), que permite, da mesma forma, o transporte da endolisina através da membrana celular com o auxílio do sistema Sec. Nestes casos, apesar da holina não apresentar um papel activo no transporte da endolisina, esta apresenta um papel crítico na activação das endolisinas e consequente determinação do tempo de lise ideal. Os fagos que infectam especificamente micobactérias designam-se micobacteriófagos. Este trabalho debruçou-se sobre o bacteriófago Ms6, um micobacteriófago temperado com um genoma de dsDNA que infecta Mycobacterium smegmatis. Tal como todos os outros fagos de dsDNA, o fago Ms6 utiliza a estratégia holina-endolisina para comprometer a integridade celular do seu hospedeiro de forma a libertar a progenia fágica no fim do seu ciclo lítico, no entanto o acesso da endolisina ao peptidoglicano é diferente de todos os modelos descritos até à data. O seu operão lítico está organizado em 5 genes. Para além da endolisina (lysA) e das holinas (gp4 e gp5), existem dois genes adicionais, gp1 e lysB, que são reflexo de um novo mecanismo de lise. lysB codifica uma enzima com actividade lipolítica, enquanto que o gene gp1 codifica uma proteína com características semelhantes às das chaperonas moleculares. O produto do gene gp1, designado Gp1, interage com os primeiros 60 aminoácidos (aa) da região N-terminal da LysA, auxiliando o acesso desta última ao peptidoglicano de forma independente das holinas. No entanto, alguns aspectos relacionados com o papel da Gp1 no processo de lise não são completamente conhecidos. Nomeadamente não se conhece o mecanismo responsável pela manutenção da endolisina num estado inactivo até ao momento da lise determinado pelas holinas. Com este trabalho pretendemos determinar a localização celular da Gp1 e da LysA durante uma infecção de forma a compreender melhor papel da Gp1 no processo de lise. Usando a técnica Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA (BRED) foi construído um micobacteriófago Ms6 recombinante contendo a extremidade 3’ do gene gp1 fundida com um tag c-Myc e a extremidade 3’ do gene lysA com um tag de 6 histidinas (His6). Depois de submeter células de M. smegmatis infectadas com o fago Ms6 gp1-c-Myc lysA-His6 a um protocolo de fraccionamento celular foi possível verificar, por Western-blot, a localização de ambas as proteínas. Apesar da sequência aminoacídica da Gp1 não prever a existência de uma sequência sinal foi possível observar que esta proteína se localiza na parede e membrana celulares. Por outro lado a localização da LysA está restrita à parede celular, o que não é surpreendente uma vez que a endolisina do fago Ms6 possui um domínio de ligação ao peptidoglicano (PGRP) entre os aminoácidos 168 e 312. Para além disso, os resultados mostram que ambas as proteínas começam a ser produzidas antes do tempo de lise e estão ausentes da fracção solúvel. Para verificar a possível existência de um péptido sinal na sequência da Gp1 gerou-se uma estirpe recombinante em que a extremidade 3’ da gp1 está fundida com o gene da fosfatase alcalina sem a sequência sinal (phoA’). Fusões com o gene phoA’ são amplamente usadas para determinar a localização celular de proteínas e a existência de sequências sinal, uma vez que esta enzima só é funcionalmente activa no ambiente oxidativo do periplasma. A ausência de actividade enzimática em meio contendo um substrato cromogénico, bem como em ensaios de quantificação em meio líquido indicam que a Gp1 está desprovida de uma sequência sinal. Por último averiguou-se ainda se a Gp1 tem a capacidade de promover a translocação dos primeiros 60 aa da LysA através da membrana citoplasmática, uma vez que estudos prévios mostram que esta região é essencial para o processo de exportação. Usando a mesma estratégia, construiu-se um plasmídeo em que a sequência que codifica os primeiros 60 aa da LysA está fundida com o gene phoA’ na presença de gp1. Os resultados obtidos indicam que apesar da região N-terminal da LysA ser essencial, esta não é suficiente para promover o transporte da PhoA’ para o espaço periplasmático de M. smegmatis na presença da Gp1. Os resultados obtidos com este estudo parecem sugerir que a Gp1 e a LysA são exportadas em conjunto tal como acontece com outras proteínas secretadas pelas micobactérias. Para além disso, a formação do complexo Gp1-LysA parece ser importante para o processo de translocação. De acordo com estas observações colocamos a hipótese de que a Gp1 poderá estar envolvida na manutenção da LysA num estado inactivo até ao momento de lise, uma vez que ambas as proteínas são exportadas enquanto estão a ser sintetizadas, no entanto são necessários estudos adicionais para confirmar esta hipótese. O estudo dos mecanismos de lise usados pelos bacteriófagos abre novas perspectivas no que diz respeito ao tratamento de infecções bacterianas. Para além disso, o estudo da cassete de lise do micobacteriófago Ms6 contribui para uma melhor compreensão dos diversos mecanismos usados pelos bacteriófagos para lisar os seus hospedeiros e lança novas questões relativamente aos mecanismos de secreção usados pelas micobactérias.
Descrição: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15916
Designação: Mestrado em Ciências Biofarmacêuticas
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