Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/15937
Título: Autoimmune antibodies anti-AchR as biomarkers in Myasthenia Gravis
Autor: Antunes, Raquel Coelho Loyo Pequito
Orientador: Gonçalves, João
Alves, José Delgado
Palavras-chave: Autoantibodies
Antibodies anti-AchR
Myasthenia Gravis
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Myasthenia Gravis (MG) is an autoimmune disease triggered by antibodies directed against proteins involved in cell signaling at the neuromuscular junctions, resulting in failure of the neuromuscular transmission and muscle weakness (Conti-Fine et al., 2006). The majority of these autoantibodies (≈85%) are directed to the nicotinic acetylcholine receptor (anti-AchR antibodies) present in skeletal muscle cells, but the exact area of the receptor that is targeted is still not known (Tzartos et al., 1991). There is however a significant group of patients that do not express these antibodies. This heterogeneity may be associated with different characteristics regarding the specific target, the affinity or avidity of the antibodies and it may account for different clinical phenotypes. Furthermore, due to the non-specificity of the drugs currently available, some patients respond poorly or not respond at all to treatment. Recently, patients with MG have been treated with Rituximab, a drug that targets CD20 positive cells, (a membrane associated phosphoprotein present in the surface of every B-cell, except stem cells, pro-B-cells and effector B-cells), and resulting in the complete depletion of circulating B-cells. However, not all patients with MG respond to this therapy. This study aimed at determining what is the specific molecular target that is bound by the pathogenic antibodies and whether these antibodies are produced by CD20-positive B cells. We started by investigating a specific region of 10-amino acid sequence (WNPDDYGGVK) corresponding to the residues 67-76 of the extracellular domain of alpha1 subunit of AchR that has been suggested to be involved as a potential target, in an animal model of MG. Simultaneously the extracellular domain of the alpha1 subunit of acetylcholine receptor (CHRNA1) was synthesized by molecular cloning, to allow the subsequent isolation of different peptides and determination of their potential role as targets. Serum samples from patients with MG were collected and tested for IgG antibodies that recognized this specific region of 10-amino acid sequence and CHRNA1 cloned protein, by enzyme-like immunosorbent assay (ELISA). Furthermore we intended to identify whether patients had CD20+ B lymphocytes involved in the production of these pathogenic antibodies, using flow cytometry. All patients gave informed consent before entering the study. We showed that the serum from seropositive patients for the AchR did not recognize the WNPDDYGGVK synthetic peptide, which suggests that the MIR peptide described to be the main immunogenic region in antibody targeting in animal models of the disease (EAMG), might not be the same in humans. However, patients with MG seropositive for the AchR had antibodies directed towards the CHRNA1 suggesting that this subunit might be the main targeted region in this disease. The detection of CD20+ B lymphocytes involved in the production of these pathogenic antibodies can provide an easy tool to identify patients that might respond to anti-CD20 drugs, such as rituximab.
A Miastenia Gravis é uma doença auto-imune caracterizada pela presença de autoanticorpos que reconhecem proteínas envolvidas na sinalização neuromuscular, desencadeando falhas na transmissão neuromuscular e fraqueza muscular (Conti-Fine et al., 2006). Maioritariamente estes anticorpos (≈85%) apresentam uma elevada afinidade para o receptor nicotínico de acetilcolina (anticorpos anti-AchR) presente nas células musculares esqueléticas (Tzartos et al., 1991). Devido à falta de especificidade dos fármacos disponíveis actualmente, alguns doentes respondem de forma incompleta, ou não respondem de todo, ao tratamento. Recentemente, alguns doentes com MG iniciaram tratamento com Rituximab, um fármaco que tem como alvo o CD20, uma fosfoproteína associada à membrana celular presente na superfície de todas as células B (excepto as células estaminais, células pró-B e as células B de memória), o que resulta na depleção das células B circulantes. No entanto, nem todos os doentes respondem de forma significativa a este tratamento. Este estudo teve como objectivo investigar quais poderiam ser as potenciais regiões antigénicas no receptor nicotínico de acetilcolina (AchR). Começámos por investigar uma região específica de 10 aminoácidos (WNPDDYGGVK) que corresponde aos resíduos 67-76 do domínio extracelular da subunidade alfa 1 do AchR. Simultaneamente, o domínio extracelular da subunidade alfa 1 do receptor de acetilcolina (CHRNA1) foi sintetizado por clonagem. Todos os doentes assinaram um consentimento informado antes de entrar no estudo. Amostras de soro de doentes com MG foram usadas para testar a existência de anticorpos IgG que possam reconhecer a sequência específica de 10 aminoácidos e também a proteína CHRNA1 clonada, por ensaio imuno-enzimático (ELISA). Além disso pretendeu-se identificar, por citometria de fluxo, se os linfócitos B envolvidos na produção destes anticorpos patogénicos são CD20+. O desenvolvimento de um método de ELISA específico mostrou que os doentes com anticorpos anti-AchR não apresentavam títulos de anticorpos que reconhecessem o péptido sintético WNPDDYGGVK, o que sugere que o péptido MIR descrito como a principal região imunogénica para os anticorpos em modelos animais da doença (EAMG), pode não ser o mesmo em seres humanos. Os resultados obtidos vi pressupõem a existência de outras regiões antigénicas no AchR nicotínico. Na sequência da identificação dos alvos específicos correctos, a detecção de linfócitos B CD20+ envolvidos na produção destes anticorpos patogénicos pode proporcionar uma ferramenta fácil de identificar doentes que possam responder a fármacos anti-CD20, como o Rituximab.
Descrição: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/15937
Designação: Mestrado em Ciências Biofarmacêuticas
Aparece nas colecções:FF - Dissertações de Mestrado

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