Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/16015
Título: How does exposure to the fungus Batrachochytrium dendrobatidis affects the tadpoles of the common tode, Bufo bufo, under different stresses?
Autor: Patrício, Pedro Miguel Brilha
Orientador: Rebelo, Rui Miguel Borges Sampaio e, 1969-
Palavras-chave: Anfíbios
Anuros
Fungos
Competição animal
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: Os anfíbios enfrentam uma crise de extinção em massa e são atualmente considerados um dos grupos mais ameaçados de vertebrados. O atual declínio global deste grupo é causado por múltiplos fatores, e um dos mais importantes é a propagação do fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que já foi documentado como agente infecioso em 350 espécies de anfíbios. Genericamente a sobrevivência das larvas de anfíbios é afectada por factores bióticos e abióticos. Como factores bióticos podemos considerar: a densidade intra e interespecífica, a competição, a pressão de predação, a estrutura da comunidade, e a doença ou a pressão parasitária. Pouco se sabe sobre o potencial de interação entre os factores bióticos e doenças, mas é aceite que o aumento de densidade intraespecífica e a pressão induzida por predadores pode potenciar a vulnerabilidade à infecção. Os efeitos das pressões de cada stresse individualmente têm sido amplamente estudados e documentados em formas larvares de anuros, mas estudos que testem a resposta a vários stresses simultâneos são escassos. Neste estudo testou-se o efeito do impacto da exposição ambiental ao agente patogénico Bd em girinos de Bufo bufo (sapo comum), quando sujeitos a diferentes fatores indutores de stresse, nomeadamente, a competição intraespecífica e a existência de sinais químicos e visuais que indicam a presença de um predador, numa experiência fatorial que testou todas as combinações possíveis dos três agentes de indução de stress considerados. Todas as experiências foram realizados no biotério da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa. O biotério foi dividido em duas seções, separadas fisicamente para evitar a contaminação: uma das seções incluiu todos os tratamentos expostos a Bd, e a outra os tratamentos não expostos. Para a realização das experiências procedeu-se à recolha de 6 posturas / casais em amplexo de B. bufo em Sintra, Portugal, assim como de exemplares de um dos seus predadores naturais (ninfas de libélula – Aeshna cyanea.). Foi colocado em todos os aquários um recipiente transparente com orifícios. Para testar os efeitos do stress provocado por predador (tratamento P) foi colocada uma ninfa de libélula nos recipientes . Para testar os efeitos do stress causado por conspecíficos (tratamento C) foi diminuído o volume de água nos aquários p ara 1/5 do volume dos outros tratamentos. Nos primeiros 4 dias da experiência procedeu-se à inoculação dos tratamentos expostos a Bd (tratamento Bd). Para tal utilizámos uma estirpe do fungo Bd altamente virulenta (BdGPL). Cada inoculação continha 50.000 zoósporos. O mesmo procedimento foi realizado com os girinos não expostos, mas inoculando apenas meio de cultura de Bd, (sem zoósporos). Quando os girinos atingiram o estádio de Gosner 25, foram distribuídos aleatoriamente por 8 tratamentos distintos com diferentes pressões associadas (sete combinações de tratamentos diferentes e um grupo não exposto a nenhum dos agentes causadores de stress). Cada tratamento tinha 6 replicados (aquários), com 6 girinos em cada aquário, perfazendo 36 animais por tratamento e 288 no total, em 54 unidades experimentais. Como variáveis de resposta, foram realizados vários tipos de registo ao longo e no fim da experiência. Em 8 ocasiões ao longo da experiência foram registados 5 tipos de comportamento dos girinos (número de girinos ativos, número de girinos a tocar no recipiente do predador, localização dentro do aquário, , número de girinos inativos à superfície do aquário e número de girinos inativos no fundo do aquário). Os períodos de observação consistiram em seis ocasiões consecutivas separadas por 15 minutos. De modo a determinar e quantificar a prevalência de Bd nos girinos expostos, um girino por aquário foi eutanasiado com uma overdose de MS222 no dia 39 da experiência. No dia 47 da experiência todos os girinos foram analisados para verificar o seu estádio de desenvolvimento (Gosner, 1960). Quando os girinos remanescentes atingiram o estádio de desenvolvimento Gosner 46 ( fim da metamorfose), a experiência foi concluída. Cada recém-metamorfoseado foi pesado e fizeram-se ensaios de capacidade de salto. Realizou-se também a avaliação da duração do período larvar e da taxa de sobrevivência de todos os girinos. Após eutanásia, procedeu-se à extração da peças bucais e dos membros posteriores de todos os girinos e juvenis. O material recolhido foi analisado por quantitative real - time polymerase chain reaction protocol (qPCR ) - TaqMan assay - a única técnica capaz de quantificar com exatidão o número de zoósporos de Bd presentes numa amostra, permitindo obter informação sobre o nível da infecção. As análises de qPCR foram realizadas no Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa. Para analisar as diferenças de comportamento entre tratamentos foram utilizados Modelos lineares generalizados mistos (GLMM) com uma distribuição de erro binomial e uma função de ligação logit (as várias observações do mesmo aquário foram incluídas como medidas repetidas). Estes foram seguidos por testes emparelhados para cada GLMM significativo. Para analisar as diferenças noutros parâmetros (massa à metamorfose, período larvar e capacidade de salto) foram utilizados Modelos lineares generalizados (GLM), considerando-se as distribuições de erro normais e funções de ligação logit, e foram realizados testes emparelhados para cada GLM significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software IBM SPSS Statistics versão 22.0.0.0. Nenhum dos girinos expostos a Bd recolhidos no dia 39 da experiência e no final da mesma estavam infectados com o fungo, assim como nenhum animal não exposto a Bd. A taxa de mortalidade dos girinos foi muito baixa e não se verificaram diferenças significativas na mortalidade entre todos os girinos expostos a Bd vs todos os não expostos.. A nível comportamental verificou-se uma interação significativa entre os três stresses estudados, originando uma diminuição da atividade dos girinos. A localização dos animais dentro do aquário foi fortemente influenciada pela interação entre a competição e Bd, na qual a exposição ao fungo aumentou significativamente o número de girinos do lado do predador. Esta mesma interação teve o mesmo efeito positivo no número de animais que tocavam no recipiente do predador. Outro parâmetro comportamental em que houve influência dos stresses analisados foi número de girinos inativos à superfície do aquário. Aqui, verificaramse várias interações significativas: i) entre C e P, que aumentou o valor; ii) entre C e Bd, com o mesmo efeito, e iii) somente Bd, em que o número de girinos à superfície também aumentou. O último parâmetro de comportamento foi o número de girinos inativos no fundo do aquário, em que houve interação significativa entre C e Bd, na qual o Bd aumentou o valor, e também efeito significativo de P, cuja presença originou uma diminuição. A análise da fase de desenvolvimento dos girinos ao dia 47 da experiência revelou que os stresses C e Bd tiveram efeitos significativos mas opostos sobre este parâmetro: a competição teve um efeito negativo no desenvolvimento dos girinos de B. bufo, enquanto que o Bd o acelerou. Em termos do período larvar dos girinos de B. bufo, encontrou-se uma interação significativa entre C, P e Bd, na qual a exposição simultânea a P e Bd diminuiu significativamente o período larvar. No entanto, não se verificaram quaisquer efeitos na massa à metamorfose. A distância máxima de salto máximo foi também afectada pela interação simultânea dos três stresses em estudo. Houve efeitos na média dos três saltos mais longos, com uma interação significativa entre C, P e Bd, na qual os recém-metamorfoseados previamente expostos a C e Bd apresentaram saltos menores. Apesar de não se ter verificado infecção por Bd em nenhum girino, os nossos resultados demonstram que o Bd pode atuar como um fator de stresse e tem impactos sobre a história de vida dos girinos de B. bufo. As respostas que encontramos incluem níveis de atividade reduzida, redução do período larvar, capacidade de salto após a metamorfose reduzida, e uso diferencial do aquário. Assim, o fungo não afeta diretamente a sobrevivência de B. bufo, mas influência parâmetros relacionados com comportamento, crescimento e desenvolvimento. O estudo não suporta a hipótese de que a exposição a pressões naturais resultantes da predação e / ou a competição aumenta a susceptibilidade a B. dendrobatidis, e mostra que uma ligação entre a exposição ao stresse e susceptibilidade à doença não pode ser assumida em todos os casos.
The current global decline of amphibians is caused by multiple factors, and one of the most important is the spread of the fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) which is directly responsible for the infection of 350 amphibian species. The factors that influence susceptibility to infection by Bd are not completely known, but it is known that factors such as density, intra-and inter-specific competition, and predation may have consequences for the development and possibly the immune system of larval amphibians. The effects of single stresses on anurans have been widely studied and documented, but studies examining the extent to which anurans can respond to multiple stresses are scarce. We tested the effect of stress-inducing factors, namely intraspecific competition, the existence of chemical and visual signals indicating the presence of a predator, and environmental exposure to Bd, in tadpoles of Bufo bufo (common toad), in a factorial experiment that tested all combinations of the three stress-inducing agents considered. Tadpole mortality was very low and not related with infection by Bd. In fact, all the tadpoles were cleared of Bd at the end of the experiment. However, our results demonstrated that the non-lethal infection by Bd can be a stressor and have impacts on larval life-history traits. The responses we found included reduced activity levels, shortened larval period, reduced ability to jump after metamorphosis, and differential use of the aquarium. So, the fungus does not directly affect B. bufo survivorship, but influences traits related to behavior, growth and development. Our study did not support the hypothesis that the exposure to natural stresses resulting from predation and/or competition increases susceptibility to B. dendrobatidis, and shows that a link between stress exposure and disease susceptibility cannot be assumed in all cases.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia da Conservação). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/16015
Designação: Mestrado em Biologia (Biologia da Conservação)
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