Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/16079
Título: Anoctamins: a novel family of ion channels with extended functions and significance in disease
Autor: Afonso, Sara Cerqueira
Orientador: Amaral, Margarida, 1958-
Kunzelmann, Karl, 1958-
Palavras-chave: Bioquímica
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana com uma prevalência de 1 em 2500-4000 nascimentos. Apresenta como sintomas característicos um declínio rápido na função pulmonar, com obstrução das vias aéreas devido à ineficaz remoção de muco e consequentes infeções bacterianas recorrentes. Estas alterações estão associadas a um ambiente de hiperinflamação, que exacerba os processos de remodelação do tecido pulmonar e acaba por culminar na fibrose dos tecidos e perda da sua função. Além deste fenótipo respiratório, os pacientes apresentam ainda insuficiência pancreática, obstrução intestinal e hepática, e elevados níveis de infertilidade masculina. Esta doença tem como causa mutações ocorridas num gene, localizado no cromossoma 7 (7q31), que codifica para uma glicoproteína com 1480 resíduos de aminoácidos, designada Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). Esta proteína tem a função de canal de cloreto (Cl-) presente na membrana apical de células epiteliais, regulando o transporte transepitelial de iões e água, quando ativada por fosforilação via proteína cinase A (PKA) dependente do cAMP. Sendo que a disrupção da função da CFTR leva a um desequilíbrio iónico do líquido que reveste as vias respiratórias, airway surface liquid (ASL), levando ao aumento de espessura e viscosidade do muco provocados pela sua desidratação. A deleção de um único aminoácido, uma fenilalanina na posição 508 (F508del) está presente em aproximadamente 90% dos pacientes com FQ, sendo a mais comum de entre as mais de 1949 conhecidas. Esta mutação afeta o correto processamento da proteína que, devido a um folding incorreto, fica retida intracelularmente a nível do retículo endoplasmático (RE) onde é rapidamente enviada para a via de degradação proteolítica do proteassoma associada ao RE, não chegando assim à membrana plasmática. A função fisiológica da CFTR no epitélio vai para além do seu papel como canal de Cl-, existindo várias evidências da sua atuação como proteína reguladora de outros canais iónicos relevantes na patofisiologia da FQ. Entre eles encontram-se o canal de sódio epitelial (ENaC) e canais de potássio como KVLQT-1. Outros canais que possivelmente interatuam com a CFTR são os canais de cloreto ativados por cálcio (CaCC) e outwardly rectifying (ORCC). Os primeiros têm a função de transporte iónico transepitelial em células secretoras e são caracterizados por apresentarem uma ativação dependente da subida dos níveis de Ca2+ intracelular. Por sua vez, os ORCC distinguem-se por demonstrarem uma relação I/V outwardly rectifying e serem ativados por despolarização celular e via PKA e UTP extracelular. A produção de corrente pelos CaCCs encontra-se aumentada nas vias respiratórias de doentes com fibrose quística, provavelmente para tentar compensar de algum modo a ineficácia da CFTR. Enquanto que a ativação dos ORCC pela PKA encontra-se afetada nos tecidos de doentes com fibrose quística. A relação da CFTR com estes canais tornou-se ainda mais interessante quando, em 2008, estes foram molecularmente identificados como Anoctaminas, uma família de dez proteínas que apresenta semelhança estrutural, com oito segmentos transmembranares e um poro entre os segmentos 5 e 6, mas diferenças em termos funcionais. A Anoctamina 1 é reconhecida como o grande componente dos CaCCs, enquanto que a Anoctamina 6 atua como ORCC. O trabalho elaborado teve como objetivo explorar esta relação entre a CFTR e as Anoctaminas (mais especificamente Ano1 e Ano6). Foi estudado o tipo de interação existente entre ambas as proteínas (física ou só funcional) e o impacto que a presença da CFTR-WT ou CFTR-F508del teria na expressão, localização celular e função da Ano1 e Ano6. Nunca esquecendo o grande potencial desta nova família de proteínas como alvo farmacológico alternativo para a terapêutica da fibrose quística. Inicialmente estudou-se a expressão endógena das anoctaminas (Ano1, 6, 9 e 10) nas células CFBE, estavelmente transfectadas com CFTR-WT ou F508del, através da técnica de PCR semi-quantitativo. De seguida, em células BHK, foi estudada a potencial influência da CFTR-WT e F508del na localização celular da Ano1 e 6, usando técnicas de microscopia. Foram também realizados ensaios de co-imunoprecipitação com o objetivo de compreender se a interação entre a CFTR e a Ano1 ou 6 seria física/direta e não só funcional. Finalmente, investigou-se o impacto da CFTR-WT e F508del na funcionalidade das anoctaminas Ano1 e 6 através de técnicas de patch clamp. Os resultados obtidos sugerem que: - Em células CFBE, a Ano6 é a Anoctamina mais expressa de entre a Ano1, 6, 9 e 10 e que estas células não apresentam expressão endógena de Ano10; - A Ano1 e 6 são significativamente mais expressas em células CFBE expressando estavelmente CFTR-WT, os níveis de mRNA da Ano9 são bastante mais elevados nas células que expressam a forma WT, mas não estatisticamente diferentes dos níveis detetados nas CFBE CFTR-F508del; - Tanto em BHK CFTR-WT como em CFTR-F508del, a Ano1 localiza-se maioritariamente na membrana plasmática. Contudo, os níveis de expressão membranar são significativamente maiores nas células que expressam CFTR-WT; - A Ano6 encontra-se não só localizada na membrana plasmática como também intracelularmente; - Tanto a Ano1 como a Ano6 apresentam uma interação direta com a CFTR-WT. No entanto, tal não acontece quando a CFTR-F508del é expressa; - A interação entre a CFTR e a Ano1 não se efetua através de proteínas de ancoragem ao domínio PDZ; - A Ano1 encontra-se constitutivamente ativa quando transientemente expressa em células BHK que expressam estavelmente CFTR-WT ou F508del; - A Ano1 parece inibir a ativação das correntes produzidas pela CFTR-WT; - As experiências funcionais corroboram a ausência de interação direta entre Ano1 e CFTR através do domínio de ligação PDZ.
Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal monogenic autosomal recessive disease in the Caucasian population. It´s characterized by a quick loss of pulmonary function, with obstruction of the airways caused by the accumulation of mucus and the bacterial infections that follows. This disease is caused by various mutations on the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene in chromosome 7 which lead to a dysfunctional product. F508del (deletion of a phenylalanine in the 508º position of the protein) is the most predominant disease-causing mutation between the 1949 already known. CFTR is expressed in luminal membranes of both secretory and absorptive epithelia, where it not only works as a chloride channel but also controls a number of other ion channels and transporters, being crucial to the ionic flow on epithelia. Among these other channels is the Anoctamins family, better known as calcium (Ca2+) -activated Cl- channels (CaCCs). CaCCs mediate Ca2+-dependent Cl− secretion in glands and flat epithelia and modify cellular responses to adequate stimuli in muscle, nerve and receptors. Some studies already reported a functional relationship between these two entities, however the mechanism behind this crosstalk is still unknown. The aim of this work was to understand whether CFTR has a regulatory role on Ano1 and Ano6 biogenesis and trafficking, beyond the apparent functional relationship and if this is impaired in CF patients. To achieve this we looked into Anoctamins’ expression, cell localization, function and direct interaction with CFTR in cells expressing WT-CFTR and in cells mimicking CF disease which expressed F508del-CFTR. This study was performed always having in mind that the disclosure of the relationship between these two protein families with similar function could shed a light on a new alternative target to fight against CF and somehow circumvent the complex process that is targeting CFTR, given the vast range of its mutations which cause an equally wide range of anomalies. The Anoctamin (Ano1, Ano6, Ano9 and Ano10) endogenous expression was quantified by semi-quantitative polymerase chain reaction (PCR) and compared in cystic fibrosis bronchial epithelial (CFBE) cells stably expressing either WT-CFTR or F508del-CFTR. Then on baby hamster kidney (BHK) cells, cell localization of Ano1 and Ano6 was evaluated both in the presence of WT-CFTR and F508del-CFTR by microscopy. Physical interaction between CFTR and Ano1 or Ano6 was also assessed by performing a co-immunoprecipitation assay. Finally, Ano1 and Ano6 functions were studied in the presence of WT-CFTR and F508del-CFTR and evaluated by patch clamp. Overall the results showed that: - For both CFBE WT- and F508del-CFTR cells, Ano6 is the most expressed anoctamin between Ano1, 6, 9 and 10 and that this cell line does not express Ano10; - Ano1 and 6 are more expressed on CFBE WT-CFTR cells when compared to F508del-CFTR, and although not statistically significant Ano9 mRNA levels are much higher in WT-CFTR expressing cells than in F508del-CFTR cells; - Ano1 is mostly located on the cell membrane in both BHK WT-CFTR and F508del-CFTR cells. However the expression level in significantly higher in WT than in F508del-CFTR cells; - Ano6 expression on the cell membrane is not so clear since that in the presence of both CFTR forms the protein was also detected intracellular; - Both Ano1 and Ano6 have a direct interaction with CFTR, although this is not true for F508del-CFTR; - The interaction between CFTR and Ano1 does not appear to be made through PDZ scaffold proteins; - Ano1 is constitutively active on both BHK cell lines stably expressing WT- and F508del-CFTR when transiently transfected with Ano1; - Ano1 seems to inhibit WT-CFTR channel activation; - The mutation into Ano1’s PDZ binding domain does not seem to affect WT-CFTR currents by Ano1, corroborating the non-interaction through the PDZ binding domain.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/16079
Designação: Mestrado em Bioquímica
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

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