Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/17977
Título: Role of transcription factors in the functional development of gamma-delta T lymphocytes
Autor: Martins, Joana Luísa de Barros
Orientador: Serre, Karine
Ferreira, António
Palavras-chave: Linófictos T gamma-delta
Citocinas
Factores de transcrição
IL-17A
IFN-γ
Teses de mestrado - 2014
Data de Defesa: 2014
Resumo: O contacto contínuo com o exterior e a vasta exposição a patogéneos levou a que, durante a evolução, organismos superiores desenvolvessem mecanismos de protecção especializados. O sistema imunitário, constituído por um vasto número de células e tecidos especializados, pode ser subdividido em dois grupos – sistema imune inato ou adaptativo – de acordo com o tipo de resposta que é desenvolvido. As células do sistema imune inato, maioritariamente localizadas em locais de alto contacto com o exterior (p.e. o epitélio), caracterizam-se pela sua resposta não especializada – e portanto, inata – que permite um rápido controlo de infecções. As células T γδ, natural killer (NK) e macrófagos são exemplos de células pertencentes a este tipo de imunidade. Por outro lado, células do sistema imune adaptativo como as células T  e células B, possuem a capacidade de desenvolver uma resposta mais duradora e especializada, que lhes permite não só combater mais eficazmente uma infecção mas também desenvolver uma memória imunitária. Uma característica funcional partilhada entre as células do sistema imune inato e adaptativo é a produção de citocinas. A sua produção e consequente secreção permitem uma melhor e mais eficaz resolução de uma infecção, através do recrutamento e activação de células do sistema imune para o local afectado. Os linfócitos T γδ em conjunto com os linfócitos T αβ CD4, produzem citocinas pro-inflamatórias como o IFN-γ e a IL-17A. Todavia, as células T γδ distinguem-se dos últimos pela sua rápida capacidade de resposta a estímulos externos, através da produção e secreção de citocinas na periferia. Esta característica advém da diferenciação dos seus progenitores em células T γδ especializadas na produção de IFN- γ (CD27+) ou de IL-17A (CD27-) no timo, ao passo que linfócitos T CD4 abandonam o timo sob a forma de linfócitos naïve, necessitando de estímulos prolongados para que se diferenciem em linfócitos T efectores. Os mecanismos moleculares que regulam os processos de diferenciação e produção de citocinas encontram-se extensamente estudados em linfócitos T αβ. O factor de transcrição T-bet, por exemplo, regula a diferenciação dos linfócitos T CD4 em linfócitos Th1 CD4 bem como a produção de IFN-γ. Contudo, pouco é conhecido relativamente aos reguladores da produção de citocinas nos linfócitos T αβ. Por esta razão propusemo-nos estudar o papel de alguns dos factores de transcrição na regulação da transcrição de citocinas como o IFN- γ e IL-17A. O paralelismo entre os linfócitos Th1 CD4 produtores de IFN- γ e os linfócitos T γδ 27+ e entre os linfócitos Th17 CD4 produtores de IL-17A e os linfócitos T γδ27- levou-nos a escolher como objecto de estudo vários factores de transcrição associados à produção destas citocinas nos linfócitos T CD4. Tendo isto, escolhemos o T-bet e o factor de transcrição Eomes, envolvido na produção de IFN-γ em linfócitos T CD8. Associados à diferenciação dos linfócitos T CD4 em Th17, vários factores de transcrição foram ainda associados à regulação da transcrição de IL-17A nestas mesmas células. De entre estes os factores de eleição para o nosso estudo foram o ROR-γt, BATF e o RORα. De modo a estudar o papel de cada factor de transcrição nos linfócitos Tγδ usámos ratinhos geneticamente modificados, nos quais cada um destes factores de transcrição se encontra deletado. Para o estudo do factor de transcrição Eomes, recorremos ao uso de ratinhos nos quais apenas células que expressam o gene RAG1 - células T e B - apresentam a deleção específica para o factor de transcrição Eomes, visto a deleção total ser letal durante a embriogénese. Através de estudos in vitro usando diversas condições de estimulação (citocinas e anticorpos monoclonais), foi-nos possível aferir quais destas permitem induzir a produção de IFN-γ em linfócitos T γδ27+ e de IL-17A em linfócitos T γδ27-. De forma a determinar o impacto que a ausência de cada factor de transcrição teria na produção de IFN-γ e IL-17A, optámos pelo o uso dos anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 no caso dos linfócitos T 27+ e das citocinas IL-1β mais IL-23 no caso dos linfócitos T γδ27-. É de salientar que na presença de IL-1β e IL-23 os linfócitos T γδ27-, como já anteriormente descrito pelo laboratório, demonstraram não só a capacidade de produzir outras citocinas em simultâneo – como a IL-17F e a IL-22 – mas também a capacidade de co-produzir IFN-γ e IL-17A. Os nossos resultados in vitro demonstraram que, na ausência de T-bet, os linfócitos T γδ 27+ possuem a mesma capacidade de produção de IFN-γ apesar de o número de linfócitos que produz esta citocina ser menor. Este resultado sugere que os linfócitos T γδ27+ possam depender parcialmente do T-bet. Por outro lado, a ausência do factor de transcrição Eomes não revelou diferenças na produção de IFN-γ, demonstrando que os linfócitos T γδ27+ não requerem Eomes para a produção de IFN- γ. Já a produção de IFN-g pelos linfócitos T γδ27- não sofreu quaisquer alterações na ausência tanto do factor de transcrição T-bet assim como na do Eomes. Estes resultados sugerem então que estes linfócitos apresentam um diferente mecanismo na regulação da transcrição do IFN-γ. Contudo, as experiências in vitro nem sempre replicam a realidade in vivo. Por esta razão e com o intuito de compreender os mecanismos de regulação da produção destas citocinas recorremos a dois modelos murinos – EAE e Listeria monocytogenes – nos quais foi demonstrada a presença de linfócitos T γδ27- produtores de IFN- γ. Contudo, o modelo experimental de esclerose múltipla (EAE), não nos permitiu observar a produção de IFN- γ em linfócitos T γδ. No entanto, através do uso do modelo de infecção (Listeria monocytogenes) foi possível observar que a ausência de T-bet leva a um desaparecimento completo das células co-produtoras de IFN- γ e IL-17A. Estes resultados sugerem assim, que linfócitos T γδ27- requererem o factor de transcrição T-bet para a produção de IFN- γ. A análise da produção de IL-17A em linfócitos T γδ27- demonstrou que estes são inteiramente dependentes do factor de transcrição ROR γt. Verificámos ainda que esta dependência não se encontra limitada à produção de IL-17A estendendo-se também ao desenvolvimento de uma população específica de linfócitos T γδ27- que apenas produz IL-17A, designada CCR6+ γδ27-. Foi também possível observar que os linfócitos T γδ27- não requerem os factores de transcrição BATF e RORα para a produção de IL-17A. Durante esta análise, contrariamente ao esperado, foi ainda detectado um aumento no número de linfócitos T γδ27- que produziam IL-17A na ausência do RORα. Estes resultados levaram-nos a prosseguir um estudo mais detalhado sobre o papel do RORα em linfócitos T γδ27-. Para estudar o papel do factor de transcrição ROR em células T γ foram usados ratinhos que expressam uma forma truncada, não funcional, do factor RORα. Ao investigar o papel do RORα nos linfócitos T γδ, deparámo-nos que o aumento no número de células produtoras de IL-17A não se devia a um impacto na diferenciação dos linfócitos T CCR6+ γδ27-. No entanto, observámos um aumento da proporção de linfócitos T γδ expressando a cadeia Vγ4 (maioritariamente produtores de IL-17A) e uma diminuição na proporção de linfócitos T γδ expressando a cadeia Vγ1 (maioritariamente produtores de IFN- γ) no seu TCR. Este aumento foi não só detectado na periferia como também no timo, em linfócitos T γδ imaturos (CD24+), sugerindo a existência de um papel do ROR no rearranjo das cadeias gamma do TCR dos linfócitos T γδ. Mais ainda, podemos observar que o aumento no número de linfócitos produtores de IL-17A, após estimulo com IL-1β mais IL-23 durante a noite, não se devia apenas a um aumento do número de linfócitos Vγ4, mas também a um aumento do número de células produtoras de IL-17A de entre a população Vγ1-Vγ4-, que acreditamos ser constituída por linfócitos T Vγ6+ γδ. Estes resultados sugerem assim que o factor de transcrição RORα possui dois papéis distintos em linfócitos T γδ , através do controlo do rearranjo das cadeias gamma dos linfócitos T γδ e da regulação da produção de IL-17 em linfócitos T V 1-Vγ 4- γδ. Em suma, os nossos resultados sugerem a existência de algumas semelhanças nos mecanismos de regulação da produção de IL-17A e IFN-γ entre os linfócitos Th1 CD4 e os linfócitos T γδ27+ e γδ27-. Especificamente, estes resultados parecem sugerir um papel do factor de transcrição RORa no desenvolvimento e produção de IL-17A em linfócitos T γδ.
γδ T cells are a major source of the proinflammatory cytokines IFN- γ and IL-17, together with αβ CD4 T helper cells. However in stark contrast with the latter, one of the main features of γδ T cells is their briskness at cytokine production in the periphery. This is mostly attributable to their programmed phenotype(s) that distinguishes IFN- γ-producing CD27+ (γδ27+) and IL-17-producing CD27- (γδ27-) subsets. Importantly, γδ27+ cells are stably committed to express Ifng but not Il17, whereas γδ27- cells spontaneously make IL-17 but can be induced to produce IFN-γ (as well as IL-17F, IL-22, GM-CSF) under specific inflammatory conditions. Our understanding of the transcriptional regulators of the production of these cytokine in both γδ T cell subsets lags behind that of CD4 T cells. Here we show that γδ T cells do not rely entirely on the same transcriptional mechanisms for their functional differentiation. Remarkably, IFN- γ production by both γδ27+ and IL17+ γδ27- T cells relies on the Th1 transcription factor (TF) T-bet but is dispensable of Eomes. This suggests a T-bet-dependent module for IFN- γ production shared by conventional CD4 T cells and innate-like γδ T cells. By contrast and to our surprise, regarding the Th17 TFs and IL-17 production, neither BATF nor RORα showed to be required by γδ27- T cells, which appear to depend solely on RORγt. Interestingly, mice lacking RORα showed an increased number of IL-17-producing Vγ1-Vγ4- cells upon stimulation as well as a change in the proportion of Vγ4+ and Vγ1+ γδ T cells. Together our findings illustrate a simpler mechanism for regulation of cytokine production by γδ T cells which allows a faster response to stimulus. In addition, our work revealed a role for RORα in the development of certain γδ T cell subsets as well as in the functional differentiation of IL-17-production.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014
URI: http://hdl.handle.net/10451/17977
Designação: Mestrado em Bioquímica
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
ulfc112494_tm_JoanaMartins.pdf2,82 MBAdobe PDFVer/Abrir    Acesso Restrito. Solicitar cópia ao autor!


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.