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Title: Forma selvagem e formas mutantes da fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) recombinante:avaliação de interacções com diferentes chaperones moleculares
Authors: Cristo, Inês Rodrigues Silva
Advisor: Leandro, Ana Paula Costa dos Santos Peralta
Santos, Mário
Keywords: Teses de mestrado
Biologia molecular
Fenilalanina
Proteínas mutantes
Issue Date: 2008
Abstract: Os chaperones moleculares desempenham um papel crucial nos vários processos celulares relacionados com a aquisição e manutenção da conformação proteica, sendo por isso peças importantes na patogénese das doenças conformacionais, nomeadamente da fenilcetonúria (PKU), uma doença genética causada por uma deficiente actividade da fenilalanina hidroxilase (hPAH). Embora seja presentemente reconhecido que a maior parte das proteínas hPAH mutantes apresentam alterações na sua conformação, são ainda escassos os conhecimentos acerca das interacções entre estas proteínas e os chaperones moleculares. Utilizando um sistema procariota, a forma selvagem e as formas de hPAH mutantes I65T, R261, R270K e V388M foram co-expressas com os sistemas de chaperones moleculares GroESL, DnaKJ e DnaKJ/GrpE. Após purificação, as proteínas hPAH recombinantes foram caracterizadas relativamente à quantidade obtida, actividade enzimática e perfil de oligomerização. A mesma estratégia experimental foi utilizada para estudar o efeito da adição do chaperone químico glicerol sobre as proteínas hPAH mutantes. Os resultados obtidos indicam que a co-expressão dos chaperones moleculares, embora induza um aumento das proteínas totais da célula, não resulta num aumento do rendimento das proteínas hPAH mutantes. No entanto, a presença de GroESL conduziu a um aumento da actividade enzimática das formas mutantes que variou entre 1,3 (I65T) e 2,8 vezes (R261Q). Na presença do sistema DnaKJ, apenas as formas mutantes I65T e R270K apresentaram um aumento de actividade de 1,3 e 2,6 vezes, respectivamente. Este aumento da actividade não foi, no entanto, acompanhado por incremento na percentagem dos tetrâmeros. Curiosamente, não foi possível observar um efeito aditivo após adição de glicerol ao sistema de co-expressão. Os dados obtidos indicam que, embora o sistema GroESL não apresente especificidade relativamente às proteínas mutantes, o efeito do sistema DnaKJ será dependente da forma mutante. Adicionalmente, os chaperones moleculares não parecem estar envolvidos no processo de montagem pós-tradução da estrutura tetramérica da proteína. Finalmente, as interacções que ocorram entre as proteínas mutantes e os chaperones moleculares não serão estabilizadas pela presença de chaperones químicos.
Molecular chaperones play a crucial role in the several celular processes related to the acquisition and maintenance of protein folding, being important pieces in the pathogenesis of conformational diseases, namely phenylketonuria (PKU), a genetic disorder caused by a deficient activity of phenylalanine hydroxylase (hPAH). Although it is now recognized that most of the hPAH mutant proteins present conformational changes, there is a lack of knowledge concerning the interactions between these proteins and molecular chaperones. Using a prokaryotic system, the wild type hPAH and the mutant forms I65T, R261Q, R270K and V388M were co-expressed with the molecular chaperone systems GroESL, DnaKJ and DnaKJ/GrpE. After purification, the yield, activity and oligomerization profile of hPAH recombinant proteins were characterized. The same experimental strategy was used for the study of the effect of the chemical chaperone glycerol on the hPAH mutant proteins. The results indicate that co-expression of molecular chaperones, although induci in the yield of the purified mutant hPAH enzymes. However, in the presence of GroESL, the enzyme activity of I65T and R261Q presented an increment of 1.3 and 2.8 fold, respectively. A similar result was obtained in the presence of DnaKJ system, where a 1.3 and 2.6 fold increase was observed for the mutant forms I65T and R270K, respectively. Contrarily to the expected, an higher level of tetrameric forms were not obtained. Furthermore, after the addition of glycerol to the co-expression system, an additive effect was not observed. The obtained data indicate that, although the GroESL system interactions are not mutant-specific, contrarily to the effect of the DnaKJ system (mutant dependent). Additionally, the molecular chaperones do not seem to be involved in the process of post-translation assembly of the tetrameric structure of the protein. Finally, the interactions that occur between the mutant protein and molecular chaperone are not stabilized by the presence of a chemical chaperone.
Description: Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), 2008, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa
URI: http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000579878
http://hdl.handle.net/10451/1814
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