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Título: Efeito do grau de superenrolamento de plasmídeos na sua estabilidade estrutural e função biológica
Autor: Lima, Joana Brissos Magalhães, 1984-
Orientador: Prazeres, Duarte Miguel de França Teixeira dos
Correia, Maria do Céu, 1951-
Palavras-chave: Biologia molecular
Teratia génica
Vectores plasmídicos
Issue Date: 2008
Resumo: Actualmente, a utilização de DNA plasmídico (pDNA) como vector em Terapia génica, e em particular nas vacinas de DNA tem vindo a generalizar-se. Estas moléculas podem existir em diferentes conformações com diversos graus de superenrolamento. Várias evidências apontam para uma relação entre este superenrolamento e o sucesso das vacinas de DNA. O objectivo principal deste trabalho foi estudar o efeito do grau de superenrolamento na estabilidade estrutural e função biológica de plasmídeos destinados a terapia génica. Utilizaram-se seis plasmídeos todos derivados do vector comercial pVAX1/LacZ, três dos quais (pVAX1/GFP-BGH, pVAX1/GFP-SV40, pVAX1/GFP-Synt) contêm o gene que codifica a proteína repórter GFP (Green Fluorescent Protein) e os outros três (pVAX1/LacZ-BGH, pVAX1/LacZ-SV40, pVAX1/LacZ-Synt), o gene que codifica a proteína repórter ß-galactosidase. Dentro de cada grupo de três plasmídeos, as diferenças situam-se a nível das sequências de poliadenilação. A utilização de técnicas baseadas na electroforese em géis de agarose das séries completas de topoisómeros, permitiram a determinação do grau de superenrolamento dos plasmídeos utilizados como modelos de estudo. A análise estrutural dos mesmos, por electroforese bidimensional e espectroscopia de dicroísmo circular, não detectou qualquer transição estrutural ou conformação alterada. Estudou-se também a influência do superenrolamento na resistência dos plasmídeos à acção da nuclease S1 e verificou-se que os plasmídeos mais superenrolados são menos resistentes. Por fim, investigou-se o efeito do grau de superenrolamento na função biológica dos vectores plasmídicos e verificou-se que a isoforma superenrolada apresenta sempre percentagens de transfecção superiores à correspondente forma relaxada.
The past decade has seen the use of plasmid DNA as a vector for gene therapy, in particular DNA Vaccines, broaden up. These therapeutic molecules may exist in several different conformations, and also in different degrees of supercoiling. Evidences show that there is a relation between the supercoiling and the vaccine's success. The scope of this research was to study the effect of different degrees of supercoiling in the structural stability and biological function of plasmid DNA, to be used in gene therapy. In order to do so, six model plasmids derived from the commercial pVax1/LacZ were used. Three of these plasmids (pVAX1/GFP-BGH, pVAX1/GFP-SV40, pVAX1/GFP-Synt) contained the reporter gene GFP (Green Fluorescent Protein) whereas, the other three (pVAX1/LacZ-BGH, pVAX1/LacZ-SV40, pVAX1/LacZ-Synt), contained the reporter gene ß-galactosidase. Within each group of the referred plasmids the differences lie specifically in the polyadenilation sequences. The use of tecniques based in agarose electrophoresis gels of all the series of topoisomers allowed to determine the degree of supercoiling of each of the plasmids used as a study model. Further structure analysis of the model plasmids by bidimensional electrophoresis and by circular dichroism has not detected any structural transition nor conformation change. The influence of supercoiling in the resistance to nucleases action was also studied, proving that the most supercoiled plasmids are more prone to the action of the S1 nuclease. Finally, the effect of the degree of supercoiling in the biological function of the DNA vaccines was also studied. The latter showed that the supercoiled isoforms of the model plasmids always presented higher transfection percentages than their corresponding relaxed isoform.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2008
URI: http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000579998
http://hdl.handle.net/10451/1816
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