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Título: Involvement of aquaporins in hydrogen peroxide permeation
Autor: Nobre, Tatiana Viegas
Orientador: Soveral, Graça
Antunes, Fernando
Palavras-chave: Aquaporins
Permeability
Hydrogen peroxide
Yeast
Heterologous expression
Catalase
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: As aquaporinas (AQPs) são uma família de proteínas transmembranares que desempenham um papel crucial a nível fisiológico e patológico na célula, em particular na progressão de alguns tipos de cancro. O seu envolvimento em várias patologias, tal como no cancro, pode ser devido à sua disfunção como canal celular, ou devido ao efeito das moléculas transportadas. Um exemplo é a molécula de H2O2, que está envolvida em processos celulares associados a condições de saúde e doença, e foi recentemente identificado o seu transporte pela AQP3. O conhecimento da regulação das AQPs, bem como da sua capacidade de permear moléculas que são intervenientes em vias de sinalização celular, como o H2O2 que está diretamente associado ao stresse oxidativo, seria um ponto de partida na identificação de novos alvos para abordagens terapêuticas. Tendo em conta o envolvimento de H2O2 em várias condições patológicas, e o facto de esta molécula estar associada com a progressão tumoral, este projeto visa investigar o papel das AQPs na permeação do H2O2. Para isso, um sistema de expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae foi utilizado com o intuito de estudar o papel de algumas isoformas de AQP de mamífero na permeação de H2O2. Numa primeira análise, foi investigado o crescimento das diferentes estirpes na presença de diferentes concentrações de H2O2 através de um ensaio fenotípico. Posteriormente, o consumo de H2O2 das diferentes estirpes foi medido utilizando um elétrodo de H2O2, e os parâmetros cinéticos foram determinados para avaliar o transporte de H2O2 através das diferentes isoformas de AQPs de mamífero. Foram determinados os respetivos níveis de expressão na membrana plasmática das seis isoformas de AQPs de mamífero estudadas, valores estes utilizados para a normalização das constantes de velocidade obtidas do consumo de H2O2. Em comparação com as células de controlo que expressam o plasmídeo vazio, as estirpes que expressam as isoformas AQP3, AQP4 e AQP5 revelaram uma taxa de permeação elevada (cerca de 40%, 50% e 60% respetivamente). Além disso, nestas estirpes transformadas a atividade da catalase, uma enzima antioxidante responsável pela degradação da molécula de H2O2, não é superior à atividade determinada nas células de controlo, confirmando-se assim que o metabolismo associado à degradação de H2O2 não está aumentado nas estirpes transformadas. Concluindo, os nossos resultados sugerem que, entre todas as isoformas de AQP testadas, a AQP3 e AQP4 facilitam a difusão de H2O2, e que a AQP5 mostra uma permeabilidade significativamente superior às outras isoformas. Estes dados apontam para o papel fisiopatológico da AQP5 que pode estar relacionado com a sua capacidade de transportar H2O2 que é uma molécula interveniente no stress oxidativo.
Aquaporins (AQPs) are a family of transmembrane proteins that have been revealed as having an important role in cell physiology and pathology, in particular in the progression of some types of cancer. The involvement of AQPs in several pathologies, such as in cancer, may be due to their dysfunction as channels and/or due to the effect of their transported molecules. An example is H2O2, a molecule involved in cellular processes associated with health and disease conditions and recently identified as transported by AQP3. Therefore, the knowledge of AQPs regulation, as well as their ability to permeate molecules involved in signaling pathways in cell, such as oxidative stress triggered by H2O2, would enable to identify novel targets for therapeutic approaches. Due to the evidences on H2O2 involvement in several pathological conditions, and their association with tumor progression, this project aims to investigate the role of AQPs in H2O2 permeation. For this purpose, yeast Saccharomyces cerevisiae strains genetically modified to express individual mammalian AQPs were used to assess the permeability of H2O2. In a first approach, the growth of each AQP-transformed strain was analyzed in presence of different H2O2 concentrations in a phenotypic assay. Then, the H2O2 consumption of each AQP-transformed strain was measured using a H2O2 electrode, and the kinetic parameters were determined for the assessment of membrane H2O2 permeation through the different mammalian-AQPs. For the six mammalian-AQPs analyzed, their level of expression at the plasma membrane was measured and used to normalize the rate constant of H2O2 consumption. Compared to control cells expressing the empty plasmid, AQP3-, AQP4- and AQP5-expressing strains showed a higher permeation rate (about 40%, 50% and 60% respectively). In addition, in these strains the catalase activity, an antioxidant enzyme responsible by H2O2 degradation, was not higher than control, assuring that H2O2 metabolism is not altered. In conclusion, our results show that among all the tested aquaporins, AQP3, AQP4 and AQP5 permeate H2O2, and that AQP5 shows a significantly higher permeability than the other isoforms. These data suggest that the mechanism of AQP5 involvement in physiopathology may be related to its capacity to transport H2O2 and interference in oxidative stress.
Descrição: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/18394
Designação: Mestrado em Ciências Biofarmacêuticas
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