Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/18401
Título: Desenvolvimento de novos compostos utilizando micropartículas e nanofibras de β-glucosidase com aplicação na indústria dos vinhos
Autor: Pinto, Ana Sofia Baptista Castro
Orientador: Ribeiro, Maria Henriques
Bronze, Maria do Rosário
Palavras-chave: β-glucosidase
Quitosano
PVA
Electrospinning
Fibras
Microesferas
Compostos fenólicos
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: Tendo-se verificado um grande crescimento das indústrias alimentares nos últimos anos, os consumidores acompanharam a tendência e tornaram-se mais exigentes relativamente à sua alimentação e aos efeitos que esta tem na sua saúde. Deste modo, as indústrias sentiram a necessidade de se adaptarem, promovendo assim o desenvolvimento de novas investigações no ramo alimentar, de forma a se compreender a influência dos alimentos e seus constituintes na saúde do Homem. As β-glucosidases são um grupo de enzimas que têm a capacidade de hidrolisar as ligações glucosídicas de glucosídeos e oligossacáridos. Na indústria dos vinhos, estas enzimas têm um grande potencial uma vez que permitem a libertação dos compostos aromáticos existentes nas uvas, mostos e vinhos. No entanto, o seu uso é limitado pela influência das características físico-químicas do meio, como o pH, a temperatura e a concentração de etanol e açúcares na actividade enzimática. Nesse sentido, este trabalho focou-se no desenvolvimento e aplicação de novas técnicas de imobilização da enzima β-glucosidase, com possível aplicação na indústria dos vinhos, de forma a desenvolver e/ou realçar os percursores aromáticos existentes nos mesmos. Recorreu-se à imobilização enzimática devido às conhecidas vantagens sobre as preparações de enzima solúvel, como por exemplo um melhor controlo das reacções, melhoria da estabilidade, possibilidade de reutilização e de um processo contínuo, assim como todas as vantagens económicas que daqui advêm. Numa primeira fase, o efeito de diferentes parâmetros cinéticos foi investigado. Determinou-se 45 °C como a temperatura óptima da enzima, com um máximo de actividade de 7,7 μM/min, e 1 mg/mL como a concentração óptima da enzima. Relativamente à actividade da enzima em substratos específicos, investigou-se o pNPαG e o pNPβG, tendo-se verificado uma grande afinidade da enzima para o substrato beta, com valores de actividade muito superiores (91,3 μM/min). A eficácia da hidrólise de substratos inespecíficos e glucosilados foi averiguada por determinação da concentração de açúcares redutores, tendo-se verificado que a estrutura complexa destes compostos não favorece o aumento da actividade enzimática. Por fim, avaliou-se o efeito da percentagem de etanol na actividade da enzima, observando-se uma tendência decrescente da quantidade de produto formado com o aumento de 1% para 20% de etanol no meio reaccional. Numa segunda fase, a enzima β-glucosidase foi imobilizada em três suportes (microesferas de quitosano, e fibras de PVA e de PVA/quitosano produzidas por electrospinning), testada em diferentes substratos e em duas matrizes alimentares (vinho Moscatel e vinho do Porto). Imobilizada em fibras de PVA, a estabilidade enzimática foi testada a 45 °C, ascendendo o seu tempo de utilização a 576h, com perdas de actividade a partir do 8º dia de reutilização. A reticulação das fibras com ácido bórico e fenilborónico a 0,5% não conferiu vantagens no aumento da actividade enzimática, no entanto o ácido bórico apresentou melhores resultados que o ácido fenilborónico. A imobilização em microesferas de quitosano apresentou valores de actividade superiores aos obtidos para a enzima na sua forma livre assim como apresentou maior estabilidade reaccional. De uma forma geral, a imobilização da enzima trouxe vantagens tanto no aumento da actividade enzimática como na estabilidade da reacção. Por fim, os três suportes de imobilização foram testados nas matrizes alimentares, tendo-se analisados por HPLC e LC-MS as amostras reacionais. Observou-se alterações nos cromatogramas, havendo formação de novos picos, o que pressupõe a formação de novos compostos. Foi possível detectar alguns compostos fenólicos em ambas as amostras e fazer uma possível identificação.
Because of food industries’ growth in recent years, consumers followed the trend and became more demanding regarding to the food they eat and the effects it has on their health. Accordingly, manufacturers felt the need to adapt, thus promoting the development of new research in food industry, in order to understand the influence of food and its constituents on human health. β-glucosidases are a group of enzymes with the ability to hydrolyze glycosidic bonds of oligosaccharides and glycosides. In wine industry, these enzymes have a great potential since they allow the release of existing aromatic compounds in grapes, musts and wines. However, their use is limited by the influence of physico-chemical characteristics of the environment, such as pH, temperature, and ethanol and sugar concentration in enzymatic activity. Thus, this work focused on the development and application of new β-glucosidase immobilization techniques, with potential application in the wine industry, in order to develop and/or enhance the existing aromatic precursors. β-glucosidase was immobilized due to the well known advantages over the soluble enzyme form, such as better controll of the reactions, improved stability, re-use, the possibility of a continuous process and all the economic advantages that arise. Initially, the effect of different kinetic parameters was investigated. Optimum temperature was determined at 45 °C with a maximum activity of 7.7 μM/min, and optimal concentration was assessed at 1 mg/mL. Enzyme activity was also assessed using specific, such as pNPαG and pNPβG, with the enzyme revealing greater affinity to the beta form, showing much higher values (91.3 μM/min). Assessment of non-specific and glucosylated substrates was also determined by the concentration of reducing sugars. It was found that the complex structure of these compounds does not favor the increase of enzyme activity. Finally, we evaluated the effect of the percentage of ethanol in the enzyme activity by observing a decreasing trend of the amount of product formed with an increase from 1% to 20% ethanol in the reaction medium. In a second step, the β-glucosidase enzyme was immobilized in three carriers (chitosan microspheres, PVA and PVA/chitosan fibers produced by electrospinning), tested on different substrates and in two food matrices (Muscat wine and Porto wine). Immobilized in PVA fibers, enzyme stability was tested at 45 °C, reaching its time of use to 576h, with loss of activity from the 8th day of reuse. Crosslinking of the fibers with boric and phenylboronic acid 0.5% did not confer advantages in the increase of enzyme activity, however boric acid showed better results than the phenylboronic acid. Immobilization in chitosan microspheres showed better activity results than those obtained for enzyme free form and greater reaction stability. In general, enzyme immobilization brought advantages both in increased enzyme activity and stability. Finally, the three polymeric supports were tested in both wines and the reactional samples analyzed by HPLC and LC-MS. Changes were observed in the chromatograms with peak formation, which suggests the formation of new compounds. It was possible to detect certain phenolic compounds in both wines and make guess identifications.
Descrição: Tese de mestrado, Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/18401
Designação: Mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos
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